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11植物组织培养-HXY_图文

植物细胞工程
?

以植物组织细胞为基本单位,在离体条件下
进行培养、繁殖或人为的精细操作,使细胞的

某些生物学特性按人们的意愿发生改变,从而
改良品种或创造新物种,或加速繁殖植物个体

,或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程


1

植物细胞工程的主要内容
? ? ? ? ?

◎ 植物细胞、组织和器官的培养 ◎ 花药培养技术 ◎ 植物原生质体的融合 ◎ 转基因植物的制作 ◎ 染色体(组)的操作技术

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植物细胞工程的发展史
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?

1902年,德国植物学家哈伯兰特(G.Haberlandt)提出植 物细胞具有全能性 1904年, Hanning,在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和 辣根菜的胚,最先将幼胚培养技术应用于育种实践的植物细胞 工程。 1934—1939年,先后发现了各种生长素,并利用番茄、胡 萝卜的离体培养,初步建立起较为成熟的细胞培养方法,使 植物细胞培养进入一个崭新的时代; 1948.中国植物生理学家崔徵和美国科学家合作发现腺嘌呤 和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。
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植物细胞工程的发展史
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?

?

?

1954.skoog发现DNA降解物中含有细胞分裂和生长的活性物 质。后被命名为激动素。 50年代主要在培养方法方面做了一系列卓有成效的工作,使 细胞培养技术日臻成熟 1960年,Morel提出了利用茎尖离体快速繁殖兰花的方法, 在此基础上,国际上建立了兰花工业,取得了巨大的经济效益 和社会效益。 1965年,Vasil等用单个胡萝卜细胞培养获得整个植株,细胞 全能性理论得到科学的验证。

4

植物细胞工程的发展史
?

?

?

?

1971年,Takebe等从烟草原生质体得到再生植株,首次获 得原生质体植株再生成功。 1972年,Carlson等通过两个烟草物种原生质体的融合,获 得了第一个体细胞杂种植株。 1973年,Nitch采用花药预培养的方法,首次获得了烟草花 粉植株。 1978年,Melchers进行了马铃薯和番茄的融合实验,获得了 第一个属间杂种植株 到目前为止,组织培养、原生质体培养 、细胞融合已在许多植物上获得再生成功。

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第11章

植物组织培养

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11.1

植物组织培养的理论基础

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植物组织培养
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?

概念:在无菌和人为控制外因的条件下 ,培养、研究植物组织器官,甚至进而 从中分化、发育出整个植株的技术。 理论基础:植物细胞的全能性——在适 宜的条件下,一个来自已分化的根、茎 、叶等组织的细胞,经过离体培养可以 发育成同其亲本一样的完整植株。
8

植物组织培养技术:

植物的无性繁殖
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11.1.1 植物的无性繁殖
?

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被子植物的两种繁殖方式:有性繁殖和 无性繁殖。 无性繁殖特点:
?

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A、不发生遗传重组,后代与亲代在遗传 上完全一致; B、可短期内获得大量后代; C、 繁殖方式多样化:营养器官再生、营 养器官变态、落地生根等
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11.1.2 植物细胞全能性理论
?

概念:植物体的每一个细胞都包含有该整个植 株所特有的全套遗传信息,都有发育成一个完 整植株的潜在能力。
表现全能性的基础和条件
?

?

?

基础: 生物体的每一个细胞都包含相同的DNA,理 论上讲,生物体的每一个活细胞都应该具有全能性 条件:离体,提供营养物质,激素,其他适宜条件 (如温度等)
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11.1.2 植物细胞全能性理论
?

几乎所有植物的体细胞、雌、雄配子体都具有全能性,都
能发育成胚和植株

? ?

全能性大小:受精卵>生殖细胞>体细胞 植物细胞全能性的差异: 根据细胞所处的组织不同从强到弱为:顶端分生组织 > 居 间分生组织 > 侧生分生组织 > 薄壁组织(基本组织) > 厚角组织 > 输导组织 > 厚壁组织。
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11.1.2 植物细胞全能性理论
?

在生物体内,由于基因的选择性表达,细胞不能表
现出全能性,而是分化成为不同的组织器官。

?

当已分化的植物器官、组织或细胞脱离母体后,在
一定的营养物质、激素等外界条件作用下分化形成

愈伤组织(一种相对没有分化的细胞团),继而在
植物激素等诱导下发生再分化,才能表达出全能性

,发育成完整植株。
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11.1.3植物细胞的脱分化和再分化
?

(1)细胞分化:细胞后代在形态结构和功能上发 生差异的过程。也可以说是相同基因型的细胞所 具有的各个不同的表现型。 它包括:
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时间上的分化:一个细胞在不同的发育阶段上可以有不 同的形态结构和功能; 空间上的分化:对于多细胞生物来讲,同一细胞后代, 由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。

?

细胞分化是一个复杂的生物化学过程,有复杂的 调控机制。营养物质和激素的种类和配比能深刻 影响分化过程,光照则是许多细胞分化的必需条 件
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?

(2)细胞的脱分化:离体培养条件下,一个已分化的细
胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细 胞状态的过程就是细胞脱分化

? ?

愈伤组织是细胞脱分化的结果 脱分化的条件:离体、避光、一定的营养物质、激素和 其他外界条件(无菌、适宜的温度等)。

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?细胞排列疏松而无规则,无组织结构

?高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞

? ?

(3)细胞的再分化和器官发生
再分化:脱分化后的分生细胞(愈伤组织)在特定的 条件下,重新恢复细胞分化能力,发育成完整生物体 ,这一过程称为细胞再分化。

?

再分化需要的条件:离体、光照、一定的营养物质、 激素和其他外界条件(无菌、适宜的温度等)

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高等植物细胞脱分化与再分化示意图

离体的植物 器官、组织 或细胞(外 植体)

脱分化

愈伤 组织

再分化

器官发 生(根 和芽) 胚状体 发生

再 生 植 株

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离体的植物 器官、组织 或细胞(外 植体)

脱分化

愈伤 组织

再分化

器官发 生(根 和芽)
胚状体 发生

再 生 植 株

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植物愈伤组织再分化的两条途径: ①器官发生途径:由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽( 或根),再在另一种培养基上产生根(或芽),形成一个 完整的植株。 ②胚状体/体细胞胚发生途径:在愈伤组织中产生出一些 与种子胚相似的结构,即同时形成一个有苗端和根端的两 极性结构,然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗, 这一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程 20 相似。

小结:几个重要概念
? ? ? ? ? ? ?

外植体〔explant〕:从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。 分化〔differentiation〕:细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改 变,从而在个发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。 脱分化〔dedifferentiation〕:已分化好的细胞在人工诱导条件下, 恢复分生能力,回复到分化组织状态的过程。 再分化〔redifferentiation〕:脱分化后具有分生能力的细胞再经过 与原来相同的分化过程,重新形成各类组织和器官的过程。 愈伤组织〔callus〕:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团 不规则细胞,多在外植体切面上产生。 胚状体〔embroid):在离体培养过程中产生一种形似胚(具有明 显的根端和芽端),功能与胚相同的结构。 继代培养:更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料(愈伤组织.芽 等)。
21

? ? ?

(4)影响植物细胞脱分化和再分化因素: 内部因子:植物的遗传性状、生理状况。 外部因子:营养条件(植物激素、无机盐、有 机营养成分等)、环境条件(培养基的pH、 渗透压、温度、湿度、光照等)。
?

?

当细胞分裂素/生长素浓度比高时,有利于芽 的发生;浓度比低时,有利于根的发生。 愈伤组织再分化过程应先诱导生芽,再诱导生 根
22

脱分化和再分化的比较:
比较内容
过程

脱分化
外植体→愈伤组织

再分化
愈伤组织→幼苗 有根、芽

形成体特 排列疏松、高度液泡 点 化的薄壁细胞

a.离体 a.离体 b.适宜的营养 b.适宜的营养 c.生长素/细胞分裂 需要条件 c.生长素/细胞分裂素 素的比例高或低诱 的比例适中 导生芽或生根 d.不需光 d.光照

?

(5)其他影响植物细胞脱分化与再分化 的条件
?

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物理因素:切割造成的机械和生理隔离,切 割创伤产生的物质。 化学因素:化学试剂,辐射处理。

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11.2 植物组织培养

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切取 外植体 移栽

无菌 接种

脱分化

诱导愈伤组织 的形成 再分化

培养室

试管苗的形成

?

植物组织培养不能有任何杂菌污染,因 此,实验器材、培养基和工作场所都要 严格消毒和灭菌。在取材。接种和培养 过程中要严格无菌操作规范。

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11.2.1 实验材料的清洗和消毒
? ? ? ?

(1)清洗 实验材料必须严格清洗,清洗过程勿伤实验材料。 (2)消毒 清洗药剂灭菌法适用于培养材料的表面消毒。外植体在 接种之前,须经严格的灭菌。由于灭菌剂的种类不同,杀菌 力不同,因此选择消毒剂,既要考虑具有良好的消毒杀菌作 用,同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解的物质,且不会 损伤或只轻微损伤组织材料而不影响生长。在使用不同的药 剂时,需要考虑使用浓度和处理时间。

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外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等都需清 洗和消毒。几种常用消毒剂的效果比较:
消 毒 剂 使用浓度(%)
70-75 10~20 消毒时间 (min.) 0.1-3 5~30

效 果
好 好

乙醇 新洁尔灭

残液去除 难易 易 易

氯化汞 过氧化氢 抗菌素 次氯酸钙/纳

0.1~1 10~12 4~50mgl-1 9 ~ 10

2~15 5~15 30~60 5~30

最好 较好 较好 好

最难 最易 较难 易

?对一些特殊生物特性的植物材料需要特殊的处理。 ?表面具较厚蜡质和角质层的,灭菌剂不易粘着,可加入少量表面活 性剂。 ?对器官外植体的灭菌,一般采用多种药剂配合使用的方法。

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★外植体的选择:一般有3种来源:一是生长在自 然环境下的植物;二是在温室控制环境条件下生 长的植物;三是无菌环境下已经过离体培养的植 物。

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外植体的选择
1、取材:从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上 取材。母株代谢旺盛期切取的外植体再生能力强, 试验容易成功。 2、外植体大小选择 :因外植体不同而不同。如 利用茎尖培养,茎尖大小对脱毒效果非常明显。 3、选择外植体的时期 :外植体的生长动态往往 与该物种的生长规律(生物钟)有关。因此,最 好在植物生长的最适宜时期取材培养,会得到较 好的结果。
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外植体的灭菌
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(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒:用清洁剂清洗---75%酒精浸泡 10-20min---无菌水洗2-3次---NaClO或升汞溶液泡10-15min--无菌水洗3-4次

?

(2)果实和种子的消毒:自来水冲洗10-30min---70%酒精漂 洗---2%NaClO液浸10min---无菌水2-3次---取出种子培养

?

(3)根及地下部器官的消毒:自来水冲洗---纯酒精漂洗---升汞
浸5-10min或2%NaClO液浸10-15min---无菌水洗3次

?

(4)花药的消毒:70%酒精浸泡数秒钟---无菌水洗2-3次---漂 白粉上清液浸10min---无菌水洗2-3次.
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外植体的灭菌
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?

?

一般情况下,如果外植体较大而且硬,可直接用消毒剂处理 ,如果实、叶片、茎段、种子等的消毒;如果是幼嫩的茎尖 ,一般先取较大的茎尖,表面消毒后,再在无菌条件下借助 解剖显微镜 取出需要的茎尖大小培养;如果是未成熟胚、胚珠、胚乳、 花药等,一般先把子房或胚珠、花蕾表面消毒,再在无菌条 件下剥出需要的外植体;如果是细胞,应按培养目的,选择 合适的起始材料进行相应的外植体消毒。 如果外植体表面污染严重,需流水冲洗1h或更长时间,或者 先通过种子培养得到无菌种苗,然后再用其他各个部分建立 组织培养。
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11.2.2 培养基
一、培养基的成分及其作用
(一)无机营养物质

1. 2. 3. 4.

无机营养物质 有机营养物质 植物激素类 固化剂和悬浮剂

培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需 要连续的供给某些无机化学物质,除了C、H、O之 外,需要量比较多的元素叫大量元素,需要量比较 少的元素叫微量元素。
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大量元素
?培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千 毫克。大量元素包括N, S, P, K, Ca, Mg。 培养基中加入量最多的是N,N一般以硝酸盐或氨 盐,或者两者结合的盐提供

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微量元素
微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所 需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co,Cl 其他一些化学药品常带有微量元素杂质,因此要注 意微量元素的用量不能过多,多会引起生长抑制等 毒害现象。

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(二).有机营养物质
有机物质包括糖类、维生素类、氨基酸类、和一些其 它的有机添加物
?

1、糖类(碳源)
糖在培养基的作用: 1)、为细胞提供合成新物质的碳骨架 2)、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 3)、维持渗透压 蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是 常用的碳源
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(二).有机营养物质

2、氨基酸类物质 绝大多数氨基酸适量时对培养效果都有正象效应。 常用的有Gly、Asn、Gln。在植物组织培养中,有时也 用水解乳蛋白和水解酪蛋白。 3、维生素类物质 维生素类物质在是多种酶的辅酶或辅基。 硫胺素(VB1)与愈伤组织的产生和生活力有关, 可能是所有植物组织培养初期需要的维生素,而盐酸吡 哆醇(VB6)促进根的生长,烟酸(VB3,又称维生素PP) 促进胚的发育。有的配方中还使用了泛酸钙(VB5)、 38 生物素(VH)、钴胺素(VB12)、叶酸(VBc),Vc等。

(二).有机营养物质
4、其它有机物质 1)肌醇(环己六醇) 肌醇可以形成果胶物质,是细胞壁的构建物 质另外还可以形成植酸,与阳离子结合或形成磷 脂,参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成 2)天然有机物 一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提 取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养,并表 现出了良好的促进作用。
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(三)、植物激素
?

植物激素是在植物体内合成的,对植物生长发 育有显著调节作用的微量有机物,而植物生长 调节剂是外源的调节植物生长发育的物质。 无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养 物的生存与最低生理活动,只有加入植物生长 调节物质,才能诱导细胞分裂、脱分化和再分 化。
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?

1、生长素类:
1)吲哚类:IAA(吲哚乙酸)、 IBA(吲哚丁酸) 、 IPA(吲哚丙酸) 2)萘酸类: NAA(萘乙酸) 3)苯氧羧酸类:2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、 2,4,5-T( 2,4,5-三氯苯氧乙酸)、 2,4,5-TP ( 2,4,5-三氯苯氧丙酸)等。 其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在,是生理活性最 强的生长素。
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生长素的生理作用
1、促进细胞生长和细胞分裂 2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力 3、形成愈伤组织,促进生根 4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定 芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱 导。

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A:NAA 0.1mg/L,芽(多),根(无),愈伤组织(少量) B:NAA 5.0mg/L,芽(少),根(多),愈伤组织(一定量
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2、细胞分裂素
是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素( 6-糠 基氨基嘌呤KT)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)和 玉米素(ZT)等。其中最常用的是6—苄基氨 基嘌呤。 ? 功能: 1、促进细胞的分裂和分化 2、诱导芽的分化 3、促进侧芽的萌发和生长 4、抑制衰老
?
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A

B

A:BA(0mg/L) ,芽(减少),根(增多)愈伤组织(一定量) B:BA(0.1mg/L),芽(适量),根(适量)愈伤组织(一定量)

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控制植物细胞分化
?

?

分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成 的一个重要条件 比例高时——产生芽,比例低时——产生 根

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促进芽的分化

生长素>细胞分裂素 利于根的分化 生长素<细胞分裂素 利于芽的分化 生长素=细胞分裂素 促进愈伤组织形成

促进根的分化

3、赤霉素(GA3)不常用
生理作用: 1、诱导茎的细胞伸长,对矮生型植物恢复成高生 型特别有效,对根无效 2、对形成层的细胞分化有影响,往往同生长素有 协同作用。IAA/GA比值高有利于木质部的分化, 比值低有利于韧皮部的分化。 3、破除种子、鳞茎、块茎休眠,使之提前萌发。 4、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用 注:不耐热,应采用过滤灭菌加入
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(四)固化剂和悬浮剂
1、固化剂 琼脂、琼脂糖(用于原生质体、细胞培养及某 些作物的花药培养) 琼脂的用量一般在7-10g/L,所购回的琼脂要 先试一下它的凝固力,一般只要能稳定的凝固就不 要多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。 2、悬浮剂 Ficoll(聚蔗糖)
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二、培养基的配方及培养基的选择
培养基的种类(根据无机盐的浓度): 1、高无机盐含量培养基
钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高,微量元素种类齐 全,比例适当,离子平衡性好,具有较强的缓冲性,养分 数量及比例比较合适,广泛用于植物的器官、花药、细胞 及原生质体的培养。主要有MS、LS、BL、BM、ER培养基。

2、高硝态氮培养基
硝酸钾含量高,氨态氮的含量低,含有较高的 VB1。主要适合与木本植物、十字花科植物和单子叶植物的 组织和花药培养。主要有B5、N6、SH培养基。
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培养基的种类(根据无机盐的浓度): 3 、中等无机盐含量培养基
大量元素约为MS培养基的一半,微量元素种类减少,但 含量较MS的高,维生素种类比MS多,如增加了生物素、叶酸 等。适合于花药培养,主要有Nitch,NT、H、Miller培养基。

4、低无机盐含量培养基
大量元素含量大幅度降低而且种类减少,有机含量相对 也很低。多数用于生根培养基,主要有White、Heller、WS、 HE、HB。

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根据培养物的培养过程,培养基分为: 初代培养基:用来第一次接种外植体的培养基 继代培养基:用来接种继初代培养物的培养基。 根据其作用不同,培养基分为: 诱导培养基,增殖培养基,生根培养基

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根据营养水平不同,培养基可分为基本培养基和 完全培养基。 基本培养基(就是通常称呼的培养基)主要有MS、 White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。 完全培养基就是基本培养基的基础上,根据试验 的不同需要,附加一些物质,如生长激素和其他 复杂有机物质等。 例如:MS + 2,4-D MS + NAA + 6-BA
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培养基的选择:
1.无机营养成分:一般在现有培养基配方中选择。可以参考 前人的经验,例如:MS是广谱性培养基,N6用于单子叶植物 的培养。豆科多用B5培养基。 2、植物生长调节剂:必须进行筛选试验。总体原则-当诱导 愈伤组织形成时,细胞分裂素和生长素相对平衡;诱导芽分 化时,细胞分裂素水平应高于生长素,诱导根则要低。 3、有机成分要根据培养类型考虑,如进行器官和组织培养, 一般不加复杂有机成分,而进行细胞和原生质体培养则要加。
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三、培养基的配制

(一)、贮备液(母液)的配制 母液有:大量元素,微量元素,铁盐,有机成分 为什么要配制母液? 1)、方便 2)、准确(有些成分量太小)

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1、大量元素母液的配制

各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍,按顺序逐步混合。
后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中,即为10倍的大量元素 母液。到入细口瓶,贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时, 每配1L培养基取此液100ml。
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注意: (1) 某些无机成分如Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等在一起可 能发生化学反应,产生沉淀物。为避免此现象发生,母液配制 时要用纯度高的重蒸馏水溶解,药品采用等级较高的分析纯, 各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合, 混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4 一等离子错开混合,速度宜慢,边搅拌边混合。 (2)CaCl2·2H2O要在最后单独加入,在溶解CaCl2·2H2O时,蒸 馏水需加热沸腾,除去水中的CO2,以防沉淀。另外, CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾,操作时要防止其溢出。
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2、微量元素母液的配制

MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物(除Fe)组成。 微量元素用量较少,特别是 CuSO4· 2O、 CoCl2· 2O , 5H 6H 因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2,表3配方, 用感量为0.0001g的分析天平称量,其它同大量元素。 配制培养基时,每配制1L培养基,取微量Ⅰ10ml,微 量Ⅱ1ml

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3、铁盐母液的配制

铁盐不是都需要单独配成母液,如柠檬酸铁,只需
和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是

硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物,必须单独
配成母液。这种螯合物使用起来方便,又比较稳定,

不易发生沉淀。配制方法同上,直接用蒸馏水加热
搅拌溶解。配制培养基时,配制1L取此液10ml。

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在配制铁盐时,如果加热搅拌时间过短,会造成Fe S04 和Na2EDTA鳌合不彻底,此时若将其冷藏,FeS04 会结晶析出。为避免此现象发生,配制铁盐母液时, FeS04 和Na2EDTA应分别加热溶解后混合,并臵于加 热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 30 min),调pH值至5 .5,室温放臵冷却后,再冷藏。
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4、有机成分母液的配制

MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟
酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有

机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸
馏水溶解,注意称量时用电子分析天平。并贮

存在棕色无菌瓶中 。
配制生物素、叶酸,用稀氨水溶解,然后定

容。
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5、植物生长调节剂母液配制
一般植物生长调节剂母液的配制的终浓度以0.5mg/ml 为好,需要注意的是: (1)配制生长素类,例如IAA、NAA、2.4-D、IBA,应先 用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解,或者用1mol/L的

NaOH溶解,然后用蒸馏水定容到一定的浓度。以后者效果
好。 (2)细胞分裂素,例如KT,应先用少量95%乙醇或无水乙 醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解,或直接用1mol/L HCl溶解, 再用蒸馏水定容。
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注意: 所有母液都要贴上标签,注明名称、配制倍数、 日期,所有的母液都应保存在0-4℃冰箱中,若母 液出现沉淀或霉团则不能继续使用。

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(二)、培养基的配制
1、计量
根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量。

2、移液
取医用瓷缸一只,加入少量的蒸馏水,按照计算吸取母液的量 依次吸取各母液臵于医用瓷量杯中备用。

3、称取琼脂、蔗糖备用 4、融化
用搪瓷量杯量取600~700ml的蒸馏水放在电炉上,加入琼脂, 边加热边用玻璃棒搅拌,直到液体呈半透明状将其取下,加入 蔗糖。
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(二)、培养基的配制
5、混合
将融化的琼脂和母液充分混合,用蒸馏水定容到1000ml,来 回混合几次。

6、调pH
用滴管吸取1 mol/L的NaOH或HCl溶液,逐滴滴入溶化的培养 基中,边滴边搅拌,并随时用精密的pH试纸调pH(5 ~6)。 注意: 高温灭菌会降低pH值(约0.2—0.3个pH值)。 不同的植物对培养基最适pH值的要求是不同的; 一般来说当pH值高于6.0时,培养基会变硬;低于5.0时,琼 脂不能很好地凝固。
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(二)、培养基的配制

7、分装
融化的培养基应该趁热分装。注意不要让培养基沾到瓶口和 瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5~1/4。 每1L培养基,可分装20~30瓶。

8、包扎
用封口膜封口,外边可加一层牛皮纸,扎好绳子,用铅笔或 碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。

9、灭菌

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湿热灭菌
适用于各种器皿、培养基、 器皿、蒸馏水、棉塞、纸 等。121℃ 维持20~ 30min 注意点:加足水、排尽气、 气压降到0时,才能开盖

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过滤灭菌
培养基的灭菌一般用高压高温处理,但如果 培养基中某些成分遇到高温分解(如某些生长调 节剂GA3、玉米素等),就需要过滤灭菌。另外酶、 血清等也需要过滤灭菌 灭菌方法:将生长调节剂或酶配成一定浓度, 用注射器注入微孔滤膜,滤膜孔径0.22~0.45微 米。制培养基时,先将培养基高压灭菌,待降至 50℃左右时,加入适量的激素,然后分装。
69

11.2.3 接种

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组织培养实验操作过程:
1、实验器具和材料的准备 2、用75%的酒精擦拭超净工作台,然后室内及超 净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意:台 面上的用品不要放臵太多或重叠放臵,以免降低 灭菌效果。 3、关紫外灯、打开风机,过5-10min进入缓冲间, 以75%洗手和手臂,更换无菌服、帽子和口罩。 进入接种室。(注:没有特别情况,尽量不要下 工作台)
71

4、用70-75%的酒精拭擦台面并消毒双手。试验 用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯,将金属器 械在其火焰上灼烧,冷却待用。 注意:所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。 金属器械不能过度灼烧,以防退火。移液管不能 灼烧,培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不 能时间太长。

72

5、取流水冲洗(至少30min)过的外植体,用一定 的消毒剂浸泡消毒,用无菌水冲洗3-4次,放入无菌 培养皿中,臵于酒精灯火焰下方,用无菌的接种器 械进行分离、切割或其他处理。 6、打开培养瓶,瓶口在灯焰处旋转灼烧,用镊子将 培养材料臵于培养基上,灼烧镊子放回,灼烧瓶口, 盖上瓶塞。 7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。
73

?注意
(1)进行培养时,动作要准确敏捷,但又不必太 快,以防空气流动,增加污染机会。 (2)不能用手触及已消毒器皿,如已接触,要用 火焰烧灼消毒或取备品更换。 (3)为拿取方便,工作台面上的用品要有合理的 布局,原则上应是右手使用的东西放臵在右侧, 左手用品在左侧,酒精灯臵于中央。 (4)工作由始至终要保持一定顺序性,组织或细 胞在未做处理之前,勿过早暴露在空气中。同样, 培养液在未用前,不要过早开瓶;用过之后如不 再重复使用,应立即封闭瓶口直立可增加落菌机 会。
74

(5)吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时, 均应分别使用吸管,不能混用,以防扩大污染或 导致细胞交叉污染。 (6)工作中不能面向操作区讲话或咳嗽,以免唾 沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。 (7)手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上 方,瓶口最易污染,加液时如吸管尖碰到瓶口, 则应将吸管丢掉。

75

接种时在近火焰处打开瓶口,使瓶倾斜, 以免空气中微生物落入瓶中

正 确

错 误
76

整个接种操作应在近火焰处进行,且动作要 迅速

正 确




77

防止操作带来的污染 接种过程中尽可能达到悬空要求








78

接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口

正 确




79

瓶盖朝上放,接种完毕后立即盖好瓶口

正 确




80

接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生

81

种子和分生组织:培养时通常将其贴放在培养基表 面,而不是插到培养基内部,以免供氧不足

正 确

错 误
82

接种茎段:注意形态学下端插入培养基内,而形 态学上端露于空气中

正 确

错 误
83

污染及其预防
人为因素(工作人员本身):工作服、帽、口罩、酒精擦手。 器 皿 和 用 具 污染来源 培养皿:洗→高压灭菌 玻璃器皿:洗→干热(干热箱)或晾干 接种用具:湿布擦→ 泡75%~95%酒精→烧

培养基:高压灭菌

物品因素

培 养 材 料

外部细菌:用水冲洗→化学药剂处理
内部细菌 茎尖培养 加抗生素:青霉素、利福平

操作的空气:洗刷地板,95%酒精擦超净工作台 , 用化学试剂薰蒸
84

培养条件的选择
培养中温度、光照、湿度等各种环境条件,培 养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都 会影响组织

85

一.光照的影响

培养中光照也是重要的条件之一,主要表现在光 强、光质、以及光周期等方面: 光周期:黑暗与光照交替的时间 光 量:光照强度 光 质:光的波长
86

1、光周期对植物细胞脱分化和再分化的效应

例1:黑暗中培养的烟草花药,其胚状体的分化与幼植物的 生长,同经光照培养一样的多 例2:短日照敏感的葡萄品种,它的茎切段,仅在短日照条 件下才能分化成根 例3:对日照不敏感的葡萄品种,可在任何光周期下分化成 根 结论:光周期的需要与否,应根据植物种类、培养的目的来 决定

87

离体培养中光周期的调节

最常用的周期是16h的光照,8h的黑暗。 愈伤组织诱导阶段,一般采用三种做法:全暗、周期 性光照、散射性光照。依据植物种类不同做法不同, 多数植物适合全暗或周期性光照, 器官发生阶段:一般给予周期性光照比较好。

88

2、光量的影响
光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响,从目 前的研究情况看,光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有 明显的影响。 一般来说,光照强度较强,幼苗生长的粗壮,而光照强度较 弱幼苗容易徒长。 离体培养条件下常用的光量,一般为1000-4000lx(勒克 斯)。离体培养中通常难以达到4000lx,一般光量在20003000lx。光照强度的高低直接影响器官分化的频率 高光量可以降低植物体内生长素水平,低光量使植物体内生 长素素水平较高,容易生根

89

3、光质的影响

?光质对愈伤组织诱导,培养组织的增殖以及器官的分 化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养,2周后, 分化出愈伤组织。但在蓝光下培养,几周后才出现愈伤 组织, 离体培养条件下,一般用日光灯进行光照,对芽分化有 效光谱成分为蓝紫光,根分化则受600-680nm所刺激。

90

二.温度的影响
培养都是在23~27℃之间进行,一般采用25±2℃。 喜温性植物:茄科、禾本科、兰科等。培养温 度一般控制在26-28℃ 冷凉性植物:百合科、十字花科、菊科等。通 常培养温度控制在18-22℃ 或<25℃

91

三.湿度的影响
组织培养中湿度的影响有两个方面:
一是培养容器内的湿度条件,容器内主要受

培养基水分含量和封口材料的影响。
一是环境的湿度条件。环境的相对湿度一般

要求70~80%。常用加湿器或经常洒水的方法来
调节湿度。

92

四.pH值
不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的, 大多在5.5-6.5左右,一般培养基皆要求5.8,这 基本能适应大多数植物培养的需要。
种类 杜鹃 越橘 蚕豆 番茄、葡萄 最适PH值 4.0 4.5 5.5 5.7
93

种类 月季 胡萝卜、石刁柏 桃

最适PH值 5.8 6.0 7.0

五.渗透压
培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物, 因而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植 物生长有促进作用,2个大气压以上就对植物生长 有阻碍作用,而5-6个大气压植物生长就会完全停 止,6个大气压植物细胞就不能生存

94

渗透压调节物质
培养基各种物质中,糖对培养基渗透压起决
定性作用。因此调节渗透压往往从调节糖浓度着 手。糖除了作为渗透压调节物质外,还是培养基 重要的碳源和能源。另外,甘露醇,山梨醇等也

可以作为调节物质。

95

六.气体

氧气是培养中必需的因素,瓶盖封闭时要考虑通 气问题,可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的 是棉塞封闭瓶口,但棉塞易使培养基干燥,夏季易 引起污染。培养室要经常换气,改善室内的通气状 况。液体振荡培养时,要考虑振荡的次数、振幅等, 同时要考虑容器的类型、培养基等。

96

97

11.2.4 种质保存
?

?

超低温保存植物材料的原理与保存动物材料相同。 在-196℃的超低温条件下,活细胞内的物质代谢和 生命活动几乎完全停止。因此,细胞、组织、器官 在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变,也 不会丢失形态发生的潜能。 在降温冷冻过程中,如果细胞内的水发生结冰,也 会造成植物细胞结构不可逆性的破坏而死亡。因此 ,种质超低温保存成功的关键是在于降温冷冻过程 避免细胞内结冻。需使用冷冻保存剂,选择合适的 降温冷冻速度和化冻方式。
98

1.超低温保存方法
? (1)材料的选择 ? 对组织培养的材料,在保存前要对其加速传代,以提高 分裂细胞的比例。 ? (2)预处理 ? 加入预冷的保护剂(0℃),处理20-60min,提高细胞抗 寒力。 ? (3)降温冰冻 ? 四种方法:1.快速冷冻2.慢速冷冻3.预冻4.逐级降温 ? (4)采用迅速解冻法。30-40 ℃。 ? (5)活力测定 ? TTC或FDA染色法测定细胞活力和存活率。 ? (6)再培养 ? 根据植物种类,提供和满足原来培养条件进行培养,使 细胞恢复分裂能力,诱导器官分化和植株再生。
99

100

2.超低温保存的意义

(1)能保持细胞培养物的稳定性。 (2)长期保存植物种质资源。 (3)长期保存农作物的优良品种及其育种亲本材料的

种质。

101

? http://www.56.com/u52/v_Mjk5Mzg5NjE.htm l ? 烟草叶片的组织培养实验操作视频: ? http://www.56.com/u97/v_OTU2NTIxMjY.htm l

102


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