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HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理

HAT 培养基筛选杂交瘤细胞的原理
HAT 培养基是指含有次黄嘌呤(hypoxantin) 、氨基蝶呤(aminopterin)和胸 腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)三种物质的细胞培养基。 1.细胞内合成 DNA 原料的核苷酸形成的途径 (1)起始合成途径(de novo pathway) : 由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,为 DNA 分子的合成提供原料。 在此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程。 (2)中间合成途径(salvage pa-thway) : 利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶 (HGPRT) 和胸腺嘧啶核苷激酶 (TK) 催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸。 2.利用 HAT 培养基筛选杂交瘤细胞 (1)经融合后细胞将以多种形式出现:融合的脾细胞—瘤细胞、融合的脾 细胞—脾细胞、融合的瘤细胞—瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及 细胞的多聚体形式等。 正常的脾细胞在培养基中存活仅 5~7 天,无需特别筛选, 细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 (2)融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的中间合成途径缺失株(例如 嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株) ,即只有起始合成途 径。效应 B 细胞虽不增殖,但有两条 DNA 合成途径。 (3)氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂,可阻碍起始合成途径。HAT 培养基中含有 氨基蝶呤时,细胞只有中间合成途径,所以必须供给核苷酸。杂交瘤细胞的起始 合成途径被氨基喋呤阻断, 但可通过中间合成途径利用以培养基中次黄嘌呤和胸 腺嘧啶脱氧核苷为原料进行合成。 而缺失中间合成途径的瘤细胞, 失去增殖能力。 从而选择出杂交瘤细胞。


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