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小麦中胆碱酯酶的提取及其在蔬菜农药残留检测中的应用研究


分析检测

小麦中胆碱酯酶的提取及其在蔬菜 农药残留检测中的应用研究
刘开华,邢淑婕 (信阳农业高等专科学校生物工程系 , 信阳 464000)
辽 摘要:初步确定了小麦中胆碱酯酶的提取工艺, 比较了不同小麦品种中胆碱酯酶的活性, 筛选出 “ 春 14 ”为试材, 分析了提取液用量、 pH 值等因素对胆碱酯酶活性的影响, 同时探讨了经硫酸铵盐析 后的胆碱酯酶用于快速检测蔬菜中农药残留的方法。

关键词:小麦; 胆碱酯酶; 酶活; 农药残留 中图分类号:TS207.5+3 文献标识码:A 文章编号:1005- 9989(2007)02- 0237- 04

S tudy on the de te ction of pe s ticide re s idue s in ve ge ta ble with choline s te ra s e e xtra cte d from whe a t
LIU Kai- hua, XING Shu- jie

(Xinya ng Agricultura l Colle ge , Xinya ng 464000)
Abstr act: variety. The extraction proces s of cholines teras e was s tudied from different materials , The effect of temperature,
“ liaochun 14 ” was

s elected to determinate pes ticide res idues by comparis on of enzyme activity of cholines teras e in different wheat pH value and volume of extraction s olution on enzymatic activity were s tudied , and the cholines teras e was purified by s alting out. On the bas e of this , an enzyme inhibition method of pes ticide res idues in vegetable has been developed. Key wor ds: wheat; cholines teras e; enzymatic activity; pes ticide res idues

收稿日期:2006- 07- 19 作者简介: 刘开华 (1969- ), 男, 讲师, 硕士研究生, 研究方向为食品安全。

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碱度而改变其在有机相和水相中分配比的方法, 有 效去除脂肪等杂质的干扰, 达到了较高的灵敏度、准 确度和精密度, 完全满足我国对于肉制品中山梨酸和 苯甲酸检测的要求, 适宜在日常检测工作中应用。
参考文献: [1] GB2760- 1996. 食品添加剂使用卫生标准 [S]
山梨酸的测定 [S] [2] GB/T5009.29- 2003. 食品中苯甲酸、

理的方法改进 [J]. 中国卫生检验杂志 ,2001,11(4):471- 471

[5] M Gonzá M Gallego, M Valcá lez, rcel. Gas chromatograph- ic flow method for the preconcentration and simultaneous determination of antioxidant and preservative additives in fatty foods [J]. Journal of Chromatography A,1999,848(7): 529- 536 [6] Elisabeth Drange, Elsa Lundanes. Determination of long- chained fatty acids using non - aqueous capillary elec- trophoresis and indirect UV detection[J]. Journal of Chro- matography A,1997,771(3):301- 309
237

[3] 马昌洪 . 高效液相 色 谱 法 测 定 肉 制 品 中 苯 甲 酸 和 山 梨 酸
含量 [J]. 遵义师范学院学报 ,2005,7(5):67- 68 山 糖 [4] 仲岳桐 . 高油脂食品中 苯 甲 酸 、 梨 酸 、 精 钠 样 品 前 处

No. 2. 2007

分析检测
目前, 农产品的病虫害防治仍以化学防治为 主, 有机磷及氨基甲酸酯类农药仍然在蔬菜、粮食等作 物上广泛使用。随着病虫害抗药性的逐年增加, 许 多蔬菜种植者一味依赖增加农药用量来保证产量, 导致蔬菜中农药残留量严重超标, 严重威胁着人们 的健康 。我国每年因食用有机磷农药超标蔬菜引起
[1]

质浓度为纵坐标, 绘制盐析曲线, 分析确定硫酸铵 的用量。 根据盐析曲线, 先添加硫酸铵至一定饱和度, 离心, 分别取若干份等体积的上清液, 用 2.0mol/L硫 酸溶液调节, 使之最终分别达到不同的 pH 值, 4℃振 荡 30min, 离心, 分别测定在不同 pH 值下上清液的酶 活力 和蛋白质 浓 度 , 以 pH 值 为 横 坐 标 、酶 活 力 和 蛋 白质浓度为纵坐标, 绘制等电点沉淀曲线, 确定最 适 pH值。由最适 pH值, 以 2.0mol/L硫酸溶液调整体系

的食物中毒事件屡有发生 , 因此, 建立一种简便、
[2]

快 速 、灵 敏 的 农 药 残 留 检 测 方 法 , 以 控 制 农 药 残 留 超标蔬菜流入市场就显得极其重要。传统的农药残 留检测方法主要是色谱法, 该法虽然定量精确、灵 敏度高, 但样品前处理复杂, 仪器设备昂贵, 分析方 法手续复杂, 需专业人员进行操作, 因此不适于市 场管理部门经常性的现场检测 。目前, 我 国学者研
[3]

pH 值后 离心得上清 液 , 于 上 清 液 中 继 续 添 加 硫 酸 铵
至一定饱和度, 4℃静置 12h, 抽滤得滤饼, 对滤饼进 行溶解, 即得第一次盐析酶液。

1.2.2.2

第二次硫酸铵盐析

在第一次盐析酶液中继

究较多的农残快速检测方法主要是酶抑制法, 该法 是基于农药对胆碱酯酶的抑制作用, 通过检测胆碱 酯酶被抑制的程度, 间接检测农产品中农药残留的 情况。植物和动物中的胆碱酯酶均有此特异反应, 植物中的胆碱酯酶的活性不如动物的高, 但其具有 取材方便、成本低、保存方便等优点 [4]。本文对小 麦 中胆碱酯酶的提取、纯化进行了探讨, 并探索了其 在蔬菜农药残留检测方面的可行性 , 为快速、经济、 准确地检测蔬菜中农药残留状况提供理论依据。

续添加硫酸铵, 使之最终分别达到不同的饱和度, 操作方法同上, 绘制盐析曲线, 确定硫酸铵用量。

1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.2.6

酶活测定方法

分光光度法 [7]。 奥氏饱和度表示法 [8]。 用含有一定浓度 紫外吸收法 [9]。

硫酸铵浓度的表示方法 蛋白质含量的测定

有机磷农药抑制率的测定 [10]

农药的缓冲溶液作为反应体系, 37℃下对胆碱酯酶进 行抑制 30min后, 测定其酶活力变化。 抑制率按下列公式进行计算: 抑制率 (%)= A0- A1 × 100

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1
试验所用小麦品种 浙丰 2号、焦农 1 号、辽春

A0

式中: A0──未受抑制酶的活力;

A1──受农药抑制酶的活力。 1.2.7
部分 蔬 菜 中 有 机 磷 农 药 残 留 的 检 测 从 市 场 上购回辣椒、西红柿、大白菜、小白菜、黄瓜、茄 子 、 芹 菜 , 用 取 样 器 分 别 切 取 蔬 菜 样 品 5g, 加 入

10号、辽春14号、冬麦9409: 均购自信阳市农业科学
研究所; 蔬菜样品购自信阳市农贸市场。

1.1.2

主要试剂

牛血清白蛋白: Sigma 公司; 固兰 B

盐 (显 色 剂 ): 武 汉 化 学 试 剂 厂 ; а 乙 酸 奈 酯 (底 物 ): - 天津化学试剂厂; 甲胺磷: 湖北省钟祥市第二化工 厂; 氧乐果: 湖北沙隆蕲春股份有限公司; 其他常规 药品均为分析纯。

10mL 0.02mol/L pH8.0 的磷 酸缓冲溶液, 振荡 10min ,
离 心 , 取 3mL上 清 液 加 入 待 测 试 管 中 , 再 加 入 50μ L 酶 液 、 50μ 显 色 剂 , 37℃水 浴 抑 制 30min , 比 色 测 L 定酶活性的变化, 从而测定酶的抑制率, 判断农药 残留情况。

1.1.3

主要仪器

7530G紫 外 - 可 见 分 光 光 度 计 : 惠

普上海分析仪器有限公司; TDL- 40B低速台式大容量 离心机: 上海安亭科学仪器厂;

2 结果与分析 2.1 胆碱酯酶提取条件的筛选

1.2 试验方法 1.2.1 1.2.2 1.2.2.1
小麦中粗酶液的提取 [5] 胆碱酯酶的纯化 [6] 第一次硫酸铵盐析 分别取若干等体积的粗 小麦或小麦粉 → 提取 液浸泡 → 研磨 → 离心分离 →上清液分装保存。

2.1.1

提取液 pH值对胆碱酯酶活性的影响 在其它条

件相同的情况下, 向小麦中分别加入小麦质量 3~ 倍 4 的不同 pH 的磷酸缓冲溶液 (0.2mol/L pH5.0~ 作为提 8.5) 取液, 于 4℃下浸泡 16h, 研磨, 5000r/min 离心 10min, 测上清液中酶 活 , 以 提 取 液 pH 值 为 横 坐 标 、酶 活 为 纵坐标绘制曲线, 结果见图 1。 从图 1 可看出, 胆碱酯酶在偏碱性的条件下反 应 较好, 而在酸性条件下, 酶的活力受到了较大的限

酶液, 在不断搅拌下, 分别缓慢加入硫酸铵, 使之最 终分别达到不同的饱和度, 4℃静置 12h, 离心得上清 液, 分别测定每个饱和度对应上清液的酶活和蛋白 质含量, 以硫酸铵饱和度为横坐标、酶活力和蛋白
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分析检测
麦 质 量 3 倍 的 磷 酸 缓 冲 溶 液 (0.2mol/L pH8.0), 在 4℃ 下 分 别 浸 泡 4h、 8h、 12h、 16h、 20h、 24h, 研 磨 ,

5000r/min 离心 10min, 测上清液中酶活, 以提 取 时 间
为横坐标、酶活为纵坐标绘制曲线, 结果见图 3。 由 图3可 知 , 酶 活 力 随 提 取 时 间 的 延 长 而 增 大 , 但超过 16h后酶活力上升不明显。本实验选择 16h 作为 提取时间。

2.2 不同小麦品种中胆碱酯酶酶活的比较
依据以上筛选出的提取条件, 对所选几种小麦中 制, 这可能与该酶分解底物乙酸萘酯所生成的产物 有关: 该酶作用于底物后生成的产物中存在乙酸 ,
[7]

的胆碱酯酶进行提取, 并测其酶活, 结果见表 1。
表1 不同小麦品种中胆碱酯酶活性比较 小麦品种 浙丰 2 号 焦农 1 号 辽春 10 号 辽春 14 号 冬麦 9409 酶活力 (U)

因此如果在酸性条件下进行酶促反应, 反应的方向就 会向着逆反应的方向进行, 从而酶的活力就会受到了 很大的抑制。相反, 如果酶促反应在偏碱性的条件下 反应 , 反应体系中的 OH 就 会 与 产 物 中 的 乙 酸 反 应 ,


15 13.2 20 29 8.9

从而减少产物的量, 有利于酶促反应向正方向进行。 所以选择pH值7.0~ 的磷酸缓冲溶液作为提取液。 8.0

2.1.2

提取液用量对胆碱酯酶活性的影响

向小麦

由 表1可 以 看 出 , 所 选 几 种 小 麦 中 ,

辽 “ 春 14”

中分别加入小麦质量 1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍 的磷酸缓冲溶液, 于 4℃下浸泡 16h, 研磨, 5000r/min 离心 10min, 测上清液中酶活, 以提取液对小麦重量 的 比 值 为 横 坐 标 、酶 活 为 纵 坐 标 绘 制 曲 线 , 结 果 见 图2。

辽 的 酶 活 力 最 高 , 其 次 是 “ 春 10” 和 “ 丰 2 号 ” 浙 , 冬 焦 “ 麦 9409” 和 “ 农 1 号 ” 的 胆 碱 酯 酶 的 酶 活 力 较 低。以下选用 “ 辽春14号”为试验材料。

2.3 胆碱酯酶的纯化 2.3.1
第 一 次 盐 析 依 照 1.2.2.1 中 方 法 , 绘 制 了 第 一 次硫酸铵盐析沉淀曲线图及等电点沉淀曲线图, 见图

4、图 5。

由图 2 可以看出, 提取液的用量过高或过低都 会 影响酶的活力, 提取液用量过低时易造成酶提取不 充分, 而过高时又会降低酶反应时的浓度, 从而都将 影响酶的活力。本试验最终选取料液比为1∶ 3。

2.1.3

提取时间对酶活的影响 向小麦中分别加入小

由图 4 可知, 随着硫酸铵饱和度的增加, 上清液 中蛋白质浓度和酶活力逐渐下降。当硫酸铵饱和度为

0.2~ 时 , 上 清 液 的 酶 活 力 下 降 最 快 , 酶 蛋 白 被 沉 0.5
淀 , 所 以 第 一 次 盐 析 时 选 择 的 硫 酸 铵 饱 和 度 为 0.2~

0.5。
由 图 5 可 知 , 当 体 系 的 pH 值 从 7.5 下 降 到 3.5 的 过 程 中 , 酶 活 力 损 失 不 多 , 为 20% , 而 杂 蛋 白 可 去 除

60%, 达到了在酶损失相对不多的前提下去除杂蛋白
的目的, 所以在第一次盐析时调整体系的 pH值为 3.5。

2.3.2

第二次盐析

将第一次盐析酶液进行第二次盐
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分析检测
以国标方法中的气相色谱法 (GC)为对照, 用自制 的酶液对信阳市农贸市场随机抽取的几种蔬菜进行 了酶抑制法检测, 结果如表 2所示。
表2 样品 小白菜 大白菜 芹菜 茄子 信阳市蔬菜抽样的农残检测结果

酶抑制法

(mg/kg) 3.60 0.34 0.20 2.43 0.00 0.00 0.25

GC (mg/kg) 3.98 0.06 0.19 2.56 0.16 0.00 0.22

是否符合酶抑制法 结果 符合 不符合 符合 符合 不符合 符合 符合

析, 盐析曲线如图 6所示。由图 6可知, 当硫酸铵饱和 度 为 0.3~ 时 , 上 清 液 中 酶 活 力 急 剧 下 降 , 说 明 大 0.5 部分胆碱酯酶已被沉淀, 所以, 添加硫酸铵的饱和 度范围为 0.3~ 。 0.5

辣椒 黄瓜 西红柿

由表 2 可知, 比色法与气相色谱法检测结果的 符 合 率 较 高 , 为 71.4% 。 另 外 , 从 表 2 中 还 可 以 看 出 , 使用酶抑制法也会产生假阳性或假阴性的结果, 假 阳性的产生可能与蔬菜中含有抑制酶活性的成分有 关, 而假阴性可能是蔬菜中农药的含量较低, 酶抑 制法的检测下限无法达到所致。诸如此类的问题如 何在检测过程中避免, 有待于进一步的研究。
参考文献: [1] 陈松 , 蔡立宏 . 农 药 中 毒 及 其 防 治 . 沈 阳 农 业 出 版 社 ,1996: 138- 143 [2] [3]
赵 丽 丽,陈 宁,张 克 旭.果 菜 中 有 机 磷 农 药 快 速 检 测 方 法 的研究 . 食品科学 ,2001,21(6):54- 57 蔡 建 荣,张 东 生,赵 晓 联.食 品 中 有 机 磷 农 药 残 留 的 几 种 检测方法比较 . 中国卫生检验杂志 ,2002,12(6):750- 752

2.4 不同浓度农药对小麦胆碱酯酶酶活力的抑制
分 别 配 制 0.1mg/kg、 0.2mg/kg、 0.5mg/kg、 1.0mg/

kg、3.0mg/kg、 5.0mg/kg、 8.0mg/kg、 10.0mg/kg浓度的
氧乐果溶液, 分别测定各浓度农药对酶的抑制率, 以浓度的对数为横坐标、抑制率为纵坐标, 绘制氧 乐果的标准工作曲线, 结果见图 7。

[4] 钟 树 明 , 袁 东 星 , 金 晓 英 , 等 . 植 物 酶 抑 制 技 术 用 于 检 测 蔬
菜 中 有 机 磷 及 氨 基 甲 酸 酯 类 农 药 残 留 . 环 境 科 学 ,2002,

21(2):189- 193 [5] 欧阳平凯 , 胡永红 . 生物分离原理及技术 (第 1 版 ). 北京 :化
学工业出版社 ,1999:71

[6] 王镜 , 等 . 生物化学 (第 3 版 ). 北京 :高等教育出版社 [7] 余孝颖 . 有机磷农 药 对 不 同 生 物 来 源 的 胆 碱 酯 酶 选 择 性
抑制的研究 . 环境科学 ,1996,17(4)41- 43

[8] 张树政 . 酶制剂工程 . 北京 :科学出版社 ,1998 [9] 韩 雅 珊 . 食 品 化 学 实 验 指 导 . 北 京 : 中 国 农 业 大 学 出 版 社 , 1996:59- 61 [10] 张会娟 . 胆碱酯酶抑制法测定蔬菜中有机磷及氨基甲酸
酯 类 农 药 的 方 法 研 究 . 硕 士 学 位 论 文 . 武 汉 :华 中 农 业 大 学图书馆 ,2003

由图 7 可知, 随着农药浓度的增加, 抑制率逐渐 增大, 酶活性降低。在浓度为 0.2~ 5.0mg/kg时, 抑制 曲线基本呈线性关系, 回归分析得该浓度范围的酶 抑 制 方 程 为 : y=14.08x+15.58, 相 关 系 数 R2 =0.9914, 说明可以用于进行农药残留量的定量测定, 但该方 程仅对有机磷农药成立。

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食品科技
—提高生活品质! ——

2.5 部分蔬菜中氧乐果残留量的检测
240
No. 2. 2007

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