tceic.com
学霸学习网 这下你爽了
相关文章
当前位置:首页 >> 理化生 >>

6章蛋白质的分离纯化和表征-教学用_图文

第 6章

蛋白质的通性、 纯化和表征

教学内容
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法 五、蛋白质相对分子质量的测定 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定

一、蛋白质的酸碱性质

蛋白质的等电点
对某种蛋白质来说,在某一pH,它所带的正电荷与负电荷恰 好相等,也即净电荷为零,这一pH,蛋白质的等电点。 ? 有中性盐时,蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离 子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离 基团结合,影响等电点。 ? 无盐类干扰时,蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来 的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液 pH称为等离子点(isoionic point,或称等离点)。等离子点是 每种蛋白质的一个特征常数。

教学内容
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法 五、蛋白质相对分子质量的测定 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定

二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
(一) 蛋白质胶体性质 (二) 蛋白质沉淀

(一)蛋白质胶体性质
分散相质点在胶体系统中保持稳定的3个条件:
? 分散相质点在1~l00 nm范围内, 在动力学上是稳定的, 介质分 子对这种质点碰撞的合力不等于零, 使它能在介质中作不断的 布朗运动; ? 分散相质点带有同种符号的净电荷,互相排斥,不易聚集成大颗 粒而沉淀; ? 分散相质点能与溶剂形成溶剂化层,例如与水形成水化层,质点 有了水化层,相互间不易靠拢而聚集.

蛋白质溶液,稳定的亲水胶体: 亲水基团与水发生水化作用; 某一pH下相同电荷。也有丁大尔现象、布朗运动以及不能透 过半透膜性质

(二)蛋白质沉淀
蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关, 影

响这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性:加人脱水
剂以除去它的水化层;改变溶液的pH达到蛋白质等电点使 质点的净电荷为零,蛋白质分子则聚集成大的颗粒而沉淀。

沉淀蛋白质的方法有以下几种:
? 盐析法:中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等),脱去水化层 而聚集沉淀,蛋白质不变性。 ? 有机溶剂沉淀法:脱去水化层、降低介电常数增加异性电荷 间的相互作用,蛋白质变性。低温操作,且尽量缩短处理时 间则可使变性速度减慢。 ? 重金属盐沉淀法:带负电荷时易与重金属离子结合成不溶性 盐而沉淀。可口服大量牛奶或豆浆等可解重金属盐中毒。 ? 生物碱试剂和某些酸沉淀法:蛋白质带正电合适与之结合沉 淀。 ? 加热变性沉淀法:加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加 热凝固

教学内容
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法 五、蛋白质相对分子质量的测定 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定

三、蛋白质分离纯化的一般原则
蛋白质纯化测总目标:增加纯度或比活力 (1)前处理:

(2)粗分级分离:
(3)细分级分离:

(1)前处理: ? 动物材料剔除结缔组织、脂肪组织; 种子材料应先去壳 和种皮以免受单宁等物质的污染, 油料种子脱脂. ? 选择适当方法,破碎组织或细胞:动物组织(电动捣碎机 或匀浆器或超声); ? 植物组织(英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用纤维素 酶); 细菌细胞(超声,与砂研磨或溶菌酶). ? 选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来. ? 如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的, 用超声波 或去污剂使膜结构解聚, 用适当的介质提取。

(2)粗分级分离: 常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法,有时 可用超过滤或凝胶过滤等方法。 (3)细分级分离:

各种层析、电泳巧妙配合, 后期可 用结晶法。

教学内容
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法 五、蛋白质相对分子质量的测定 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定

四、蛋白质的分离纯化方法
① ② ③ ④ ⑤ 根据分子大小不同 利用溶解度差别 根据电荷不同 利用选择性吸附 利用对配体的特异生物 学亲和力的纯化方法 ( 一) ( 二) ( 三) ( 四) ( 五) ( 六) ( 七) ( 八) 透析和超过滤 凝胶过滤 盐溶和盐析 有机溶剂分级分离法 凝胶电泳和等电聚焦 离子交换层析 亲和层析 高效液相层析

(二)凝胶过滤
凝胶过滤层析、大小排阻层析或凝胶渗透层析
? 常用凝胶:交联葡聚糖、聚丙烯酰 胺凝胶,琼脂糖(sepharose 或 Bio-Gel A); ? 凝胶网孔大小一定,只允许相应大 小的分子进入凝胶颗粒内部,大分 子则被排阻在外,即分级分离范围 或排阻极限; ? 大分子从颗粒间隙流下来,洗脱液 体积小。小分子在颗粒网状结构洗 脱历程长,后洗脱下来,洗脱体积 大; ? 用洗脱体积同标准分子量的蛋白质 的比例关系测定蛋白质分子量;

几个要说明的问题
? Vt: 柱床总体积,常称柱床体积; ? V0 :为孔隙体积或外水体积,测出不 被凝胶滞留的蓝色葡聚糖-2000的洗脱 体积即为V0; ? Vi :内水体积,凝胶珠内部的水相体积; ? Vm :为凝胶基质体积; ? Vt=V0+Vi+Vm ? Ve某一待分离物质组分的洗脱体积,自 加样品开始到该组分的洗脱峰(峰顶)出 现时所流出的体积;
? ? ? ? ?

V0

Vt-V0

Vt

? 各组分的流出顺序,可用分配系数Kd 来量度: Kd=(Ve-Vo)/Vi。

Kd:组分分子大小的函数; 完全排阻的大分子:Ve=V0,Kd=0; 完全进入凝胶珠的小分子: Ve=V0+Vi,Kd=1; 其他的:Kd在0和1之间; Kd大于1:凝胶对组分有吸附

几个要说明的问题
测得几种标准蛋白质的洗脱 体积 Ve 以相对分子质量对数 (logM) 对 Ve 作图,得标准 曲线,再测出未知样品洗脱 体积[Ve],从标准曲线上可 查出样品蛋白质的相对分子 质量.

V0
? ? ? ? ?

Vt-V0

Vt

Kd:组分分子大小的函数; 完全排阻的大分子:Ve=V0,Kd=0; 完全进入凝胶珠的小分子: Ve=V0+Vi,Kd=1; 其他的:Kd在0和1之间; Kd大于1:凝胶对组分有吸附

(三)盐溶和盐析
? 盐溶:一般在低盐浓度的情况下,蛋白质的溶解度随盐 浓度的升高而增加,这种现象称为盐溶; ? 盐析:当盐浓度升高到一定程度后,蛋白质的溶解度又随 着盐浓度的升高而降低,结果使蛋白质沉淀析出,这种 现象称为盐析; ? 同一浓度盐溶液中,不同蛋白质的溶解度不同,借此可 达到彼此分离的目的。 ? 盐溶原理:蛋白质吸附某种盐离子后彼此排斥。 ? 盐析原理:盐浓度增高到一定数值后,水活性降低,水 化膜相继被破坏,最终引起蛋白质分子间相互聚积并从 溶液中析出

(四)有机溶剂分级分离法
? 降低水溶液的介电常数,破坏大分子周围水膜,使溶质溶 解度降低; ? 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而 使蛋白质分离的方法,有机溶剂沉淀法。经常使用的有机 溶剂是乙醇和丙酮; ? 易使蛋白质和酶变性,操作必须在低温条件下进行.

(五)凝胶电泳和等电聚焦

Sample Well Direction of migration

电泳:在外电场的作用下,带电颗粒,例如带电的蛋白质分子,将向 着与其电荷符号相反的电极移动,这种现象称为电泳 (electrophoresis)或离子泳(ionophoresis)。

电泳原理:
带电颗粒在电场中泳动时,受到两种方向相反的作用力:

U F (电场力 ) ? qE ? q d

Ff (摩擦力 ) ? fv
q: 颗粒所带电量;E:电场强度=U/d ;U:两电极间的电势差 (V);d :两电极间距离(cm);f 摩擦系数; v :泳动速度(cm /s); 当颗粒以恒稳速度移动时, 则F-Ff = 0

v q ? E f
在一定介质中对某一蛋白质来说, q/f 是一定值,因而 v/E 也是 定值,它被称为电泳迁移率或泳动度: μ= v/E

等电聚焦 (IEF)

A stable pH gradient is Protein solution is added established in the gel after and electric field is application of an electric field. reapplied.

After staining, proteins are shown to be distributed along pH gradient according to their pI values.

pH梯度制作:利用两性电解质(商品名: Ampholine),多氨基多羧 酸系列两性化合物同系物的复杂混合物,它们有相近但不同的 pH和pI值,在电场作用下,自然形成pH梯度.

双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)

First dimension Isoelectric focusing

Isoelectric focusing gel is placed on SDS polyacrylamide gel.

Second dimension SDS polyacrylamide gel electrophoresis

(七)亲和层析(affinity chromatography)
① 利用蛋白质分子对其配体(或称 为配基)分子特有的识别能力建 立起来的纯化方法. ② 将特异配体共价地连接到像琼脂 糖凝胶这类载体表面的官能团 (如-OH)上,配体和多糖载体之 间插人一段长度适当的连接臂 (如ε-氨基己酸),使配体与凝胶 之间保持足够的距离,不致因载 体表面的位阻妨碍待分离的分子 与配体结合. ③ 这类载体在其他性能方面允许蛋 白质能自由通过.
琼脂糖凝胶珠
杂蛋白分子 (不被吸附) 洗涤 除去 连接臂 亲和洗脱

配体分子

被吸附的蛋 白质分子 亲和层析的原理

(八) 高效液相层析 (high performance liquid chromatography, HPLC)
是离子交换层析、凝胶过滤、 吸附层析和分配层析等技术的 新发展. 对柱层析来说,固相载体的颗 粒愈小、分辨率愈高, 但是洗 脱液的流速也愈慢。采取高压 和机械性能强、化学性能稳定、 颗粒度细小而均匀的载体和其 他设备自动完成分离纯化. HPLC可用于蛋白质、氨基酸及 其他生物分子的分析和制备。
溶剂储存器 溶剂过滤器 进样室

恒温装置 泵 层析柱 检测仪 记录仪 收集器

教学内容
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法 五、蛋白质相对分子质量的测定 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定

五、蛋白质相对分子质量的测定
(一) 凝胶过滤法测定相对分子质量 (二) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 (三) 沉降速度法测定相对分子质量

(一)凝胶过滤法测定相对分子质量
① 蛋白质过凝胶柱速度直接取决于它的 斯托克半径。如某种蛋白质与一理想 的非水化球体具相同过柱速度即相同 的洗脱体积,则这种蛋白质具与此球 体相同的半径,称斯托克半径。 ② 标准蛋白质(已知Mr和斯托克半径)和 待测蛋白质须有相同分子形状(接近球 体),否则不能得到比较准确的Mr. ③ 一般用交联葡聚糖(Sephadex), Sephadex G-75(分级分离的Mr范围3 000~80 000)或G-100(M,范围4000~ 150 000).

1966, Andrews提出个经验公式:

lg M r ? a ? bVe

(二)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量

? SDS破坏蛋白氢键和疏水相互作用, 巯基乙醇能打开二硫 键, SDS和巯基乙醇存在下,单体蛋白或亚基(寡聚蛋白质解 离成亚基) 处展开状态. ? SDS 烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体. 在 一定条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比: 1.4g SDS / 1 g 蛋白质,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子SDS. ? SDS 与蛋白质结合后: 第一, SDS 阴离子使多肽链覆盖上 相同密度的负电荷, 远超过蛋白质原有电荷量, 掩盖了不同 蛋白质间原有的电荷差别; 第二, 改变蛋白质的天然构象, 使大多数蛋白质采取类似的形状. 因此在 SDS 存在下的电 泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的.

(二)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量
SDS-PAGE,迁移率不受蛋 白质原有的电荷、分子形 状等因素影响, 但凝胶具分 子筛效应. 因此,迁移率与 相对分子质量(Mr)之关系:

lg M r ? a ? b?r
常数 相对迁移率: 样品迁移距离 /前沿(染料)

(三)沉降速度法测定相对分子质量
直接测定蛋白质Mr的方法:渗透压法、光散射法、沉降速度法、 沉降平衡法和黏度法等,沉降速度法是经典的常用方法. ? 超速离心机最大转速: 60000~80 000r/min, 相当于位于距转轴 中心10 cm处、单位质量(1g)分子所受到的离心力(离心场强度) 为400 000 ×g~700 000 ×g. ? 沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关,且与溶剂密度 和黏度有关. ? 单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数, 用s(小写)表示:
离心角速度(rad/s): 转速(r/min) ×2π/ 60

s?

dx / dt ?2x

时间 从轴心到沉降界面的径向距离(cm)

(三)沉降速度法测定相对分子质量
蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数:1 ×10-13~200 ×10-13秒范围. 把l0-13s 作为一个单位, 斯维得贝格单位 (Svedberg unit)或称沉降系数单位, 用S(大写)表示. 例如人血 红蛋白: 4.46S, 即4.46 ×10-13s。 蛋白质的沉降系数(s)与相对分子质量(Mr)的关系可用斯维 得贝格方程表达:
摩尔气体常数(8.314J· K-1· mol-1); 蛋白质的扩散系数(cm2/s), 数值上等于当 浓度梯度为1个单位时在1 s内通过1 cm2面 积的蛋白质质量 热力学温度(K),旧称绝对温度

RTs Mr ? D(1 ? v? )

沉降系数

偏微比体积(cm3/g) 又称偏微比容,蛋白质 溶于水的偏微比容约0.74 cm3/g

溶剂的密度(g/cm3)

六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 (一) 蛋白质含量测定
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 凯氏定氮法:已不多用 Folin-酚试剂法(Lowry法): 基于Cu2+→Cu+ 双缩脲法 紫外吸收法: 精确度不高,操作简便, 样品可回收, 适用于核酸测定 染料结合法(Bradfold法): 考马斯亮蓝G-250结合法, 灵敏度高(1μg), BCA法: 新开发的,碱性条件, 4,4′-二羧-2,2′-二醌(CBA)与Cu+形成紫色 复合物, 反应比Folin-酚试剂更强 ⑦ 生物活性测定法: 利用酶或激素特有的活性测定 ⑧ 抗原-抗体法: 没特异生物学活性的蛋白,注入动物体内产生抗体, 利用 抗原-抗体反应测定蛋白含量 ⑨ 生物学活性测定和总蛋白量测定配合: 鉴定纯化程度(比活力)

(二) 蛋白质纯度鉴定
常用电泳法(IEE、PAGE和SDS-PAGE)、HPLC法、免疫学方法等. 此外, N末端分析也用于纯度鉴定

基本要求
1. 2. 3. 4. 5. 6. 掌握蛋白质的酸碱性质。 掌握测定蛋白质相对分子质量的常用方法。 掌握蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀的方法和原理。 掌握蛋白质分离纯化的一般原则。 熟悉蛋白质分离纯化的常用方法。 掌握蛋白质含量测定与纯度鉴定的常用方法。

作业题:第1、2、3、8、9、10题


推荐相关:

6章蛋白质的分离纯化和表征-教学用_图文.ppt

6章蛋白质的分离纯化和表征-教学用 - 第 6章 蛋白质的通性、 纯化和表征 教

6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用_图文.ppt

6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用 - 选填,简要介绍文档的主要内容,方便文档

章蛋白质的分离纯化和表征教学用_图文.ppt

章蛋白质的分离纯化和表征教学用 - 第 6章 蛋白质的通性、 纯化和表征 教学内

第6章 蛋白质的分离、纯化和表征.ppt

第6章 蛋白质的分离、纯化和表征_生物学_自然科学_专业资料。第6章 蛋白质的分离纯化和表征 一、蛋白质的两性电离及等电点蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱...

第六章 蛋白质的分离纯化和表征_图文.ppt

六章 蛋白质的分离纯化 和表征 一、 蛋白质的性质 1. 蛋白质的酸碱性蛋白质

第六章:蛋白质的分离纯化和表征_图文.ppt

六章 蛋白质的分离纯化和表征 重点: 一、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 二、

第7章 蛋白质的分离、纯化和表征_图文.ppt

第7章 蛋白质的分离纯化和表征_理学_高等教育_教育专区。第7章 蛋白质的分离纯化 和表征 Protein Separation, Purification and Characterization OUTLINE ? ...

第七章蛋白质的分离纯化和表征_图文.ppt

第七章蛋白质的分离纯化和表征 - 第七章 蛋白质的分离纯化和表征 ? ◆一、蛋白

第7章蛋白质分离纯化与表征解析_图文.ppt

第7章蛋白质分离纯化与表征解析 - 第7章 蛋白质的分离纯化和表征 一种蛋白质的混合物在pH6的DEAE-纤维素柱中被分离,用 pH6稀盐缓冲液可以洗脱C,用pH6的高...

蛋白质的分离纯化和表征_图文.ppt

蛋白质的分离纯化和表征 - 第7章 蛋白质的分离纯化和表征 一、蛋白质的两性电离

第7章+蛋白质分离纯化与表征_图文.ppt

第7章 蛋白质的分离纯化和表征 蛋白质纯化应根据研究工作和生产的具体目的和要求,

第7章蛋白质的分离纯化和表征ppt课件_图文.ppt

第7章 蛋白质的分离纯化和表征 一、蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质含有酸/碱A

第3章 蛋白质的分离、纯化和表征_图文.ppt

第3章 蛋白质的分离纯化和表征 - 第3章 蛋白质的通性、纯化和表征 蛋白质

蛋白质的分离、纯化和表征_图文.ppt

蛋白质的分离纯化和表征 - 蛋白质的分离纯化和表征 一、蛋白质的理化性质 (

第7章-蛋白质的分离纯化和表征_图文.pdf

第7-蛋白质的分离纯化和表征 - 华中科技大学,生命科学与技术学院本科生物化学

第07章 蛋白质的分离、纯化和表征_图文.ppt

生物化学网络教程 蛋白质的分离蛋白质的分离纯化和表征 南昌大学生命科学院

王镜岩-生物化学-第7章_蛋白质的分离纯化和表征_图文.ppt

王镜岩-生物化学-第7_蛋白质的分离纯化和表征 - 第7章 蛋白质的分离纯化和表征 一、蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大...

生物化学第7章蛋白质的分离、纯化和表征_图文.ppt

生物化学第7章蛋白质的分离纯化和表征 - 第7章 蛋白质的分离纯化和表征 (Isolation,purification and characteristics of proteins) ...

第三章 蛋白质的通性、纯化和表征_图文.ppt

第三章 蛋白质的通性、纯化和表征 - 第3章 蛋白质 的分离 纯化和 表征 一.

第3章 蛋白质的分离、纯化和表征_图文.ppt

第3章 蛋白质的分离、纯化和表征 - 第3章 蛋白质的分离纯化和表征 一、蛋白质

网站首页 | 网站地图
All rights reserved Powered by 学霸学习网 www.tceic.com
copyright ©right 2010-2021。
文档资料库内容来自网络,如有侵犯请联系客服。zhit325@126.com