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基因工程题库及答案汇编


基因工程题库及答案汇编 一、填空题 1.基因工程是 年代发展起来的遗传学的一个分支学科。基因工程技术的诞生,使人们从简单地利用现存的生物资源进行诸如发酵、 的时代。 、 和 等三种主要生产方式,大量取得过去 酿酒、制醋和酱油等传统的生物技术时代,走向 2.随着基因工程技术的诞生和发展,人类可以通过 只能从组织中提取的珍稀蛋白,用于研究或治病。 3.Cohen 等在 年构建了第一个

有功能的重组DNA 分子。 , ; 等在 (2) 和 。 。 。 4.基因工程的两个基本特点是: (1) 5.基因克隆中三个基本要点是: 6. 年,美国斯坦福大学

上发表了题为: “将新的遗传信息插入SV40 病毒DNA 的生物化学方法:含有λ噬菌体 ; (2) ;(3) ; (4) 。

基因和E.coli 半乳糖操纵子的环状SV40 DNA”的论文,标志着基因工程技术的诞生。这一工作具有划时代的意义,但是他们并没有 7.克隆基因的主要目的有四:(1) 填空题答案 1. 70;按人们的需要而定向地改造和创造具有新的遗传性品种。2. 细菌发酵;真核细胞培养;乳腺生物反应器。3. 1973 4. (1)分子水平上的操作;(2)细胞水平上的表达。5. 克隆基因的类型;受体的选择;载体的选择 6. 1972;P.Berg;Proc.Natl.Acad.Sci.USA;证明体外重组的 DNA 分子具有生物学功能 7. (1)扩增 DNA; (2)获得基因产物;(3)研究基因表达调控;(4)改良生物的遗传性 二、选择题(单选或多选) 1.因研究重组DNA 技术而获得诺贝尔奖的科学家是( ) (a)A.Komberg (b)W.Gilbert (c)P.Berg (d) B.McClintock 2.第一个作为重组DNA 载体的质粒是( ) (a) pBR322 (b)ColEl (a)EcoRI (b)EcoB (c)pSCl01 (d)pUCl8 (c)EcoC (d)EcoRⅡ (c)外切酶Ⅲ (d)DNA 连接酶 3.第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是( ) 4.P Berg 构建SV40 二聚体时用了几种不同的酶,其中( )的作用是制造隐蔽的5’端。 (a)末端转移酶 三、简答题 1.为什么说基因工程技术是60 年代末70 年代初发展起来的? (b)λ外切核酸酶 选择题(单选或多选)答案:1.C;2.C;3.a;4.b。

答: 这是因为: (1)1967 年发现了连接酶; (2)大肠杆菌的转化技术是 1970 年获得突破; (3)限制性内切核酸酶的分离始于 1970 年; (4)Berg 在 1972 年构建了第一个重组的 DNA 分子。 2.重组DNA 的含义是什么? 答:将一个生物的 DNA 片段插入到一个载体中,并引入到另一生物体中进行繁殖。 3.如何理解基因工程的两个特点? 答: 基因工程的两个基本特点是分子水平的操作和细胞水平的表达。 分子水平的操作包括 DNA 分离、 切割和连接(还有其他一些 DNA 的 修饰等)。由于体外重组 DNA 的最终目的是要改变生物的遗传性,所以分子水平的操作和细胞水平的表达是基因工程的两个最基本的特点。 4.在Cohen 构建有生物功能重组体的第一步实验中,用EcoRI 切割了R6-5 质粒,然后转化E.coliC600,在卡那霉素抗性子板上筛选到了 pSCl02,它是由R6-5 的三个EcoRI 片段组成,请推测这个质粒具有什么遗传特性? 答:至少可说明两点:(1)pSC 102 含有复制起点,是一个独立的复制子;(2)重组 DNA 分子中的卡那霉素抗性基因得到了表达。 5.什么是动物乳腺生物反应器? 答:能够分泌乳汁的转基因动物生产其他来源的基因产品,并通过乳腺分泌出来。 四、问答题 1. S.N Cohen 于1973 年构建了三个重组体,pSCl02, pSCl05,pSCl09 请说明这三个重组体是如何获得的?各说明了什么? 答:pSCl02:用 EcoRI 切割 R6-5,混合转化大肠杆菌,在卡那霉素抗性平板上选择了一个克隆,并从该克隆中分离了重组质粒 DNA, 命名为 pSCl02。该质粒是由质粒 R 6-5 的 EcoRI 酶切片段Ⅲ、V 和Ⅷ在体内连接的,说明可以利用体内连接构建重组体。 pSCl05:作者分别用 EcoRI 切割质粒 pSC 101、pSC 102,然后加入 DNA 连接酶进行连接后转化大肠杆菌,在四环素和卡那霉素双抗性 的平板上筛选到 pSC 105。说明用质粒作为载体,体外连接可得到有功能的重组体。 pSCl09:pSC 101 与 RSF 1010 的共整合,即用 EcoRl 分别切割这两个质粒,然后在体外进行重组。说明两个独立的复制子体外重组后 仍具有生物功能。 2. 基因克隆是如何使含有单个基因的 DNA 片段得到纯化的? 答:大分子量的 DNA 会含有许多特殊限制性内切核酸酶的限制位点,因此用一种限制酶处理一完整染色体或整个基因组会产生许多不

同的 DNA 片段,每一个片段带有基因组的一个不同的基因或一个不同的小片段。当全部片段与用同种限制酶处理过的载体分子混合时(图 A14.1), 每个片段将插入一个不同的载体分子(比如一个质粒), 同样地, 当用这些质粒转化宿主细胞时, 每个宿主细胞将只接收一个质粒 DNA 分子而筛选出的含重组质粒的每个菌落实际上会含有某一特异的供体 DNA 片段的多个拷贝。一旦带有待研究的特定基因的克隆被确认了, 此重组 DNA 分子可从宿主细胞中提取出来进行纯化。

五、概念题 1.遗传工程:是遗传学和工程学相结合的一门技术科学。借用工程技术上的设计思想,在离体条件下,对生物细胞、细胞器、染色体或 DNA 分子进行按图施工的遗传操作,以求定向地改造生物的遗传性。遗传工程的概念有广义和狭义之分。 2.生物技术:又称生物工艺学,生物工程学。是根据生物学、化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细 胞组分,进而利用生物体所具有的功能元件(如基因、蛋白质)等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术。它包括基因工程、细胞工程、 酶工程和发酵工程等。 3.基因工程(geneengineering):也称基因操作(genemanipulation)、重组 DNA(recombinant DNA)。基因工程是以分子遗传学理论为基础,以分 子生物学和微生物学的现代方法为手段,将不同来源的基因(DNA 分子),按预先设计的蓝图,在体外构建杂种 DNA 分子,然后导人活细胞, 以改变生物原有的遗传特性,获得新品种,生产新产品,或是研究基因的结构和功能。 4.细胞工程(cellengineering):应用细胞生物学的原理和方法,结合工程学的技术手段,按照人们预先的设计,有计划地改变或创造细胞遗传 性的技术,以及在体外大量培养和繁殖细胞,或获得细胞产品,或利用细胞体本身的技术领域。主要内容包括细胞融合、细胞拆合、染色体 转移、基因转移、细胞或组织培养等。由于所用细胞的来源不同,细胞工程又分为微生物细胞工程、植物细胞工程、动物细胞工程等。 5.细胞分泌工程:是根据细胞内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技术,主要是通过对基因改造,如基因缺失、多效分 泌突变、周质泄漏突变或拼接信号肽基因等措施,促进基因产物分泌的技术。 6.酶工程(enzymeengineering):又称为酶技术。它是围绕着酶所特有的生化催化特性,结合现代化的技术手段,在体外模拟或在常温常压下 生成酶反应的产品;以及利用重组 DNA 技术定向改变酶,进行酶的修饰,或酶的全人工合成。其主要内容包括酶的化学修饰、酶的固定化、 酶反应器等。 7.蛋白质工程(protein engmeenng):是更广义上的包括酶工程在内的蛋白质修饰操作,通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特 殊功能的非天然蛋白质的技术。主要是根据蛋白质的结构和功能间的相互关系,利用基因工程技术,或用化学方法合成基因、改造基因,以 便合成新的蛋白质,或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。 8.发酵工程(fermentation engineering):又称微生物工程,微生物发酵工程。利用生物,主要是微生物的某种特定功能,通过现代化工程技术 手段,生产有用物质,或把微生物直接用于某种工业化生产的一种技术体系。主要内容包括菌种选育,发酵生产微生物,或植物细胞的代谢 产物,生产微生物菌体,最佳培养条件的优化组合等。 9.移动基因(movable gene)又叫转座元件(订 ansposable element)。是一类可以在同种 DNA 或异种 DNA 间移动的基因,但这种移动只是移动 一个拷贝,在原来的位置仍保留一份拷贝。移动基因最早是 B.McClintock 夫人 1951 年在玉米中发现,她因此获得 1983 年医学和生理学诺 贝尔奖。 10.断裂基因(splitgene,intermptedgene)是被间隔序列间隔成若干部分,而形成不连续形式的基因,是真核基因的普遍形式。断裂基因首先在 腺病毒中发现。将断裂基因中不出现在成熟 mRNA 中的部分称为内含子(inffon),出现在成熟 mRNA 上的部分称为外显子(exon)。如卵清蛋白 基因有 7 个内含子。 11.重叠基因(overlapping gene)是指一个基因的序列中,含有另一基因的部分或全部序列。即一段 DNA 序列中含有合成两个或两个以上的多 肽的基因。重叠包括编码区和控制区的重叠。基因重叠现象是英国分子生物学家 Sanger 1977 年在测定噬菌体 9X174 的 DNA 序列时发现的, 在噬菌体~X174 的 9 个基因中,O 基因与 A 基因重叠,而 E 基因与 D 基因重叠。 12.假基因(pseudogene)是一类在基因组中稳定存在,序列组成也酷似正常基因,但不能表现出任何功能的 DNA 序列。它是相应的正常基因 突变而丧失活性的结果。从机理上推测,有可能是插入或缺失引起了移码突变或者是点突变,改变了一些剪接信号使之不能正常加工,或是 mRNA 反转录后再插入的结构。

第二章 一、填空题

限制性内切核酸酶 的酶。基因工程中把那些具有识别 现象。 ,这是 的

1.严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是 内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。 2.

年 Luria 和 Human 在 T 偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的

3.1970 年,Smith 和 Wilcox 从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶,能够特异性的切割 DNA,这个酶后来被命名为 第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。

4. 通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段, 可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点 相互位置的 。 亚基所组成。它们的作用底物为双链 DNA,极少数Ⅱ类酶也 ,产生 。 。 5.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小.一般在 20~40kDa,通常由 求,因此,Ⅱ类酶既具有 末端的 DNA 片段或 专一性,也具有 的 DNA 片段。作用时需要

可作用于单链 DNA,或 DNA/RNA 杂合链。这类酶的专一性强,它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求,而且对更远的碱基也有要 专一性,一般在识别序列内切割。切割的方式有 作辅助因子,但不需要 (2) 和

6.完全的回文序列具有两个基本的特点,就是:(1) 7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别 性内切核酸酶识别序列具有 的活性;γ亚基的作用则是 9.个体之间 DNA 限制性片段长度的差异叫

个碱基,也有识别多序列的限制性内切核酸酶。根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析,限制 倾向,即它们在识别序列中含量较高。 作用;β亚基具有 。 。 ,第二、第三两个字母取自 。 。 等。 。 。 。 。 。 ,另一种是 。 ,它们属于 ,

8.EcoK 是 I 类限制性内切核酸酶,分子组成是α2 β2 γ,分子量 300kDa。在这些亚基中,o 亚基具有

10.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的,第一个大写字母取自 第四个字母则用 表示。 ,Y 和 (3) 11.限制性内切核酸酶 Acy I 识别的序列是 5’—GRCGYG-3’,其中 R 12.在酶切反应管加完各种反应物后,需要离心 2 秒钟,其目的是 13.部分酶切可采取的措施有:(1) 14.第一个分离的限制性内切核酸酶是 (2)

;而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是

15.限制性内切核酸酶 BsuRI 和 HaeⅢ的来源不同,但识别的序列都是

16.由于 DNA 是由 4 种碱基组成的,所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是 17.Sal I 和 Not I 都是哺乳动物中识别序列稀有的酶,在哺乳动物基因组的 5kb 片段中,找到 NotI 切点的概率是 18.部分酶切是指控制反应条件,使得酶在 DNA 序列上的识别位点只有部分得到切割,它的理论依据是 19.I 类限制酶识别 DNA 的位点和切割的 DNA 位点是不同的,切割位点的识别结合有两种模型,一种是 20.限制性内切核酸酶通常保存在 填空题答案 浓度的甘油溶液中。

1. 限制—修饰系统的一个组成部分;双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割 DNA 双链结构 2.1952; 限制和修饰。 3.HindⅡ。4.限制性酶切图谱 5.2~4 个相同的;切割位点;识别位点的;平切和交错切;平;具有突出黏睦末端;Mg2+;ATP;SAM 6?能够在中间划一个对称轴,两侧的序列两两对称互补配对;?两条互补链的 5’ →3’的序列组成相同,即将一条链旋转 180°,则两条链重叠 7. 4~6;GC。8. 限制性内切核酸酶的作用; 甲基化酶;识别 DNA。9. 限制性片段长度多态性(RFLP)。 10.属名的第一个字母;种名的前两个字母;株名。11.代表 A 或者是 T;代表 G 或者 C。12.混合均匀;防止部分酶切 13.(1)减少酶量;(2)缩短反应时间;(3)增大反应体积。 14.EcoK;EcoRl。 15.GGCC;异源同工酶。 16. 4n。 17.1/200 18.酶切速度是不均衡的 二、判断题 1.限制与修饰现象是宿主的一种保护体系,它是通过对外源 DNA 的修饰和对自身 DNA 的限制实现的。 2.限制性内切核酸酶在 DNA 中的识别/切割位点的二级/三级结构也影响酶切效率。一般来说,完全切割质粒或病毒 DNA,要比切割线 状 DNA 需要更多的酶,最高的需要 20 倍。 3.如果限制性内切核酸酶的识别位点位于 DNA 分子的末端,那么接近末端的程度也影响切割,如 HpaⅡ和 MboI 要求识别序列之前至少有 一个碱基对存在才能切割。 4.能够产生防御病毒侵染的限制性内切核酸酶的细菌,其本身的基因组中没有被该核酸酶识别的序列。 5.限制性图谱与限制性片段长度多态性(RFLP)图谱的最显著的区别在于前者是一个物理图谱而后者是一个连锁图。 6.用限制性内切核酸酶 HaeⅢ分别切割载体 DNA 和供体 DNA 后,可用 E.coli DNA 连接酶进行连接。 7.已知某一内切核酸酶在一环状 DNA 上有 3 个切点,因此,用此酶切割该环状 DNA,可得到 3 个片段。 8.迄今所发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链 DNA,又能作用于单链 DNA。 9.基因工程中使用的Ⅱ类限制性内切核酸酶不仅有内切核酸酶的活性,而且有甲基化酶的活性。 ’。19.限制酶移动;DNA 弯曲。 20. 50%

10.DNA 多态性就是限制性片段长度多态性。 11.用限制性内切核酸酶 PstI 切割质粒 pBR322 后,再用外切核酸酶 ExoⅢ进行系列缺失,可得到一系列大小不同的缺失突变体。 12.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变,是导致一些酶的星活性的主要原因之一,防止的办法是在酶切反应体系中,将甘油 的浓度控制在 5%以下。 13.具有 EcoRⅡ末端的外源片段只能以一个方向插入到 EcoRⅡ末端的载体中。 14.从 Esherichiacoli K 中分离的限制性内切核酸酶命名为 EcoK。 15.同一种限制性内切核酸酶切割靶 DNA,得到的片段的两个末端都是相同的。 16.在限制与修饰系统中,修饰主要是甲基化作用,一旦位点被甲基化了,其他的限制性酶就不能切割了。 17.稀有酶是指那些识别序列很长又不常用的限制性内切核酸酶。 判断题答案 1. 错误。 对外源 DNA 的限制,对自身 DNA 的修饰。2. 正确。3. 正确。 4. 错误。细菌本身基因组中核酸酶的识别序列因 C 或 A 残基的甲基化作用而受到保护,可免遭切割。 5. 正确。6. 错误。限制性内切核酸酶 HaeⅢ切割 DNA 产生平末端的 DNA 片段,E.coliDNA 连接酶不能连接平末端。7. 正确。 8. 错误。9. 错误。Ⅱ类限制性内切核酸酶没有甲基化酶的活性。 10.错误。DNA 多态性是指中性突变不低于 1%的一种群体,一般是不能检测的。如果这种突变发生在限制性内切核酸酶的识别位点上, 就会改变酶切的模式,可以通过电泳检测出来。所以,RFLP 是 DNA 多态性的一部分。 11.错误。限制性内切核酸酶 PstI 切割 DNA 后产生 3,突出的黏性末端,而外切核酸酶 ExoⅢ只能从突出的 5,端降解 DNA。 12.正确。13.正确。14.错误。应是 EcoK。15.错误。同一种限制性内切核酸酶切割靶 DNA,得到的片段的两个末端不一定相同。如果 识别序列不是完整的回文序列,产生的末端就不相同。 16.错误。限制与修饰是一对保护系统,修饰了就不能被同一系统中的限制性内切核酸酶切割,但是对不同限制—修饰系统中的酶没有作用。 17.错误。在某种生物基因组 DNA 中切割频率很低的酶称为稀有酶。 三、选择题(单选) 1.关于宿主控制的限制修饰现象的本质,下列描述中只有( (a)由作用于同一 DNA 序列的两种酶构成 )不太恰当。 (d)不同的宿主系统具有不同的限制—修饰系统 ) (b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶

(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对 DNA 进行修饰 (a) J.Lederberg (b) WArber 11.第一个被分离的Ⅱ类酶是: (a)EcoK (a)有对称轴 (a)反应时间 (b)HindⅢ ( (c) H.Smith ) (d)EcoB (d) FSanger

10.因研究λ噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是:(

(c)HindⅡ

12.双链 DNA 中一段自我互补的序列被称为回文序列,这种序列一般具有下列特征: ( (b)两条链的 5’→ 3’方向的序列相同 (b)酶量 (c)反应体积
2+

) (d)可增强基因的表达

(c)是Ⅱ类酶的识别序列 ) (b)柠檬酸钠

13.在下列进行 DNA 部分酶切的条件中,控制那一项最好?( (d)酶反应的温度 ) ) (a)EDTA 14.在下列试剂中,那一种可以螯合 Ca 离子?(

(c)SDS

(d)EGTA

, (d)Bal 31 核酸酶

15.在下列工具酶中,那一种可以被 EGTA 抑制活性?( 16.限制性内切核酸酶可以特异性地识别: ( (a)双链 DNA 的特定碱基对 17.在下列酶中,催化反应不需要 ATP 的是( 19.限制性内切核酸酶的星号活性是指:( ) )

) (a)S1 单链核酸酶

(b)末端转移酶

(c)碱性磷酸酶 (d)以上都正确

(b)双链 DNA 的特定碱基序列 (a)EcoK

(c)特定的三联密码 (c)T4DNA 连接酶 (b)E.coRI )。 (a)Sau3AI

(b)EcoB

(d)BamHl (c)hindIII (d)Sau 3A1 (d)识别序列与原来的完全不同

18.下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中,正确一项的是( (a)在非常规条件下,识别和切割序列发生变化的活性。 20.下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( (a)甘油含量过高 (a)酶失活 (b)反应体系中含有有机溶剂 (b)蛋白质(如 BSA)同 DNA 结合 )是不正确的 )

(b)活性大大提高


(c)切割速度大大加快

(c)含有非 Mg2 的二价阳离子 (c)酶切条件不合适

(d)酶切反应时酶浓度过低 )

21.DNA 被某种酶切割后,电泳得到的电泳带有些扩散,下列原因中,那一项不太可能?( 22.关于回文序列,下列各项中,( (a)是限制性内切核酸酶的识别序列 (a)由作用于同一 DNA 序列的两种酶构成 选择题(单选或多选)答案

(d)有外切核酸酶污染 (d)是高度重复序列

(b)是某些蛋白的识别序列

(c)是基因的旁侧序列

23.关于宿主控制的限制修饰现象的本质,下列描述中只有(

)不太恰当 (d)不同的宿主系统具有不同的限制—修饰系统

(b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶

(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对 DNA 进行修饰

1.b;

2.C;

3.b;

4.C;

5.C;6.b,d;

7.c;

8.a,e;

9.b,c,d,e;

10.b;11.c; 22.d; 23.b

12.a,b,c;13.b; 四、简答题

14.d;

15.d 16.b;

17.d;

18.d;

19.a;

20.d; 21.a;

2.说明 SangerDNA 测序法的原理。 答: SangerDNA 测序法是建立在两个基本原理之上:(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由 5,端向 3,端聚合(DNA 聚合酶参与了细 菌修复 DNA 合成过程);(2)可延伸的引物必须能提供游离的 3,羟基末端,双脱氧核苷酸由于缺少游离的 3,羟基末端,因此会终止聚合 反应的进行。如果分别用 4 种双脱氧核苷酸终止反应,则会获得 4 组长度不同的 DNA 片段。通过比较所有 DNA 片段的长度可以得知核苷 酸的序列。 3.在酶切反应缓冲液中加入 BSA 的目的是什么?机理是什么? 答:目的是保护酶活性,机理是通过提高溶液中蛋白质的浓度,防止酶失活。 4. Fredrick 和 McClarin 等用一个由 13 个碱基对的 DNA 片段与 EcoRI、反应,然后分离到酶和 DNA 共结晶的复合物,通过 X 射线分 析发现了什么? 答:发现:具有活性的 EcoRI 是一个二聚体,它们同 DNA 结合形成一个直径为 50A 的球形结构,两个 EcoRI 位于 DNA 的两侧。 5. 有些噬菌体和质粒常常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统。 你认为噬菌体和质粒还有哪些可能的方式避免宿主的限制作用? 答:某些噬菌体的基因组中有修饰的碱基,因此对限制性内切核酸酶具有免疫作用。另一种避免限制酶切割的途径是抑制 SAMase 的活性, 该酶制造 S—腺苷甲硫氨酸。某些限制酶作用时需要 S—腺苷甲硫氨酸。然而,噬菌体在发育过程中不能同某些单碳的供体反应。 6.某学生在用 EcoRI 切割外源 DNA 片段时,出现了星号活性,请分析可能的原因? 答:盐离子浓度不对,温度不对,甘油浓度过高。 7.在序列 5’—CGAACATATGGAGT-3’中含有一个 6bp 的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列,该位点的序列可能是什么? 答:回文序列是:5’-CATATG-3’ 8.下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列:GAATCG,AAATTT, 答:GATATC;AAATUF,因为它们是回文序列。 9.用连接酶将 Sau 3AI(,bGATC)切割的 DNA 与经 BamHI(G↓'GATCC)切割的 DNA 连接起来后,能够被 BamHI 切割的机率有多大(用百分 比表示)? 答:25%。 10.用 Klenow 酶填补的办法可使 5’黏性末端转变成平末端。这种方法常使 DNA 上的某些限制酶的识别位点消失。请问,对于下列限制 酶,用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失? BamH I(G↓GATCC); Taq I(T↓CGA), BssHⅡ(G↓CGCGC)。 答: BssHⅡ不会。 11.请推测细菌的染色体上是否会有编码识别 8 个碱基的内切酶? 怎样验证? 答:关于这个问题没有明确的答案。这些酶的作用不仅仅限于噬菌体的感染,因为大多数噬菌体并不含有 8 个碱基序列的酶切位点,一种可 能是 8 个碱基的酶是质粒整合后加上去的,作为质粒附加系统的一部分。 12.当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时,若要进行双酶切,应采取什么措施?为什么? 答:注意星活性,先低盐,后高盐;先低温酶,后高温酶;并且可以直接在换酶前将第一种酶失活,再加第二种酶,否则,易产生星活性。 或使用通用缓冲液。 五、问答题 1.什么是细菌的限制—修饰系统(restriction-modificationsystem,R-Msystem) 答:细菌中有作用于同一 DNA 的两种酶,即分解 DNA 的限制酶和改变 DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且,这两种酶作 用于同一 DNA 的相同部位,把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。 2.细菌的限制—修饰系统有什么意义? 答:不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将 DNA 中某些碱基进 行甲基化修饰,由于宿主自身 DNA 上的这些位点进行了修饰,限制酶就不能进行切割。由于外来的 DNA 在相应的碱基上没有被甲基化, 宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我,并将人侵的外来 DNA 分子降解掉。所以 DNA 限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。 3.说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 答:限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号。基本原则:3—4 个字母组成,方式是: 属 名+种名+株名+序号;首字母:取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母:取种名的第一个字母,斜体小写; 第三字母:(1)取种名的第 二个字母,斜体小写;(2)若种名有词头,且已命名过限制酶坝,j 取词头后的第一字母代替。第四字母:若有株名,株名则作为第四字母, 是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体。顺序号:若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以 I、Ⅱ、Ⅲ、…等,用正体。 8.双酶消化法(doubledigests)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理。 答:双酶消化法是绘制 DNA 中两个或两个以上限制性内切核酸酶图谱所采用的方法。做法是在两个限制性内切核酸酶分别单独消化 DNA 分子的基础上,然后再用这两个酶同时或先后消化此 DNA,根据它们的结果,构建物理图谱。 10.限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。 当 DNA 序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时,或当 DNA 片段的插入、缺失或重复导致基因组 DNA 经限制性内切核酸 酶酶解后,其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分时,DNA 多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析,这种多态性称为限制性片段长度 多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。 GATATC,ACGGCA?为什么?

11.计算下列三种酶各自在某染色体 DNA 序列上识别位点间的平均距离: Alu I: 5’ AGCT 3’, 3’ TCGA 5’ EcoR I: 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAGG 5’ Acy I: 5’ GPuCGPyC 3’ 3’ CPyGCPuG 5’ (注: Py 二任何一种嘧啶:Pu 二任 何一种嘌吟)

12.在细菌质粒 pBPI 的四环素抗性基因 tet R 的中间有一个 HindⅡ的切点。用 Hind Ⅲ切割果蝇基因组 DNA,以 pBPl 为载体构建基因 组文库。 分子杂交证明克隆 15 带有果蝇的目的基因。 用 Hind Ⅲ和 EcoRV 对克隆 15 进行了酶切分析, 电泳结果如图 15. 1(用酶切的 pBPl 质粒 DNA 作对照),旁边标出了片段的大小。

图 15.1

酶切电泳图谱

1~2: HindⅢ切割;3—4:EcoRV 切割;5—6:HindIII+EcoRV; 1、3、5 是质粒 DNA; 2、4、6 是 15 号克隆。

(1)绘制含有插入片段和不含插入片段时的 pBPl 的限制性图谱,并标明四环素抗性基因的位置; (2)如果用克隆在另一个与 pBPl 完全不同源载体上的四环素抗性基因作为探针进行 Southern 印迹杂交, 预测上述电泳图会出现怎样的杂交带 (3)如果用克隆 15 的果蝇 DNA 片段作为探针进行 Southern 印迹杂交,放射自显影的结果又是如何? 答: (1) 酶切图谱示于图 A15.1

图 A15.1 13.为什么大多数内切酶被称为“限制”酶。

限制性图谱 (3) (2)项中没有带的都有带,有带的都没有带。

(2)除 No.2 的 2.5kb,No.6 的 1.5kb 和 1.0kb 没有带外,其他都有带。

答: 大多数内切核酸酶是限制性的内切核酸酶,只在特定的位点(即一段特定的核酸序列或甲基化核苷酸)作用。另外,限制性内切核酸酶主 要是用来切割外源片段(例如侵染的噬菌体 DNA)。 噬菌体对宿主具有专一性, 因为在其他生物中, 其 DNA 会成为细胞限制系统攻击的对象。 从这种意义上说是内切核酸酶限制了噬菌体的宿主范围。 14.据 Science 杂志报道:一种重要的遗传疾病可由导致 DNA 中碱基替换的诱变剂在体外进行人工诱导。设计一种快速用以鉴定疾病基因 型的检测方法。 答: 这要求基因座已被作图,其目的在于分离基因,测定核苷酸序列以及确定是否碱基替换突变。碱基替换突变可以改变 DNA 修饰酶(例 如甲基化酶、限制酶)的识别序列。 15.为了绘制长为 3.0kb BamHⅠ限制性片段的限制性图谱,分别用 EcoRI、HpaⅡ、EcoRI+HpaⅡ消化这一片段的三个样品,然后通过凝 胶电泳分离 DNA 片段,溴化乙锭染色后观察 DNA 带型(图 15.2)。请根据这些结果,绘制一个限制性图谱,要标明 EcoRI 和 HpaⅡ识别 位点间的相对位置,以及它们之间的距离(kb)。

图 15.2

用 EcoRI、HpaⅡ单独切割及用这两种酶

图 A15.2

3.0kb 的 BamHI 片段的限制性酶谱 数字表示片段的大小(kb)

混合切割 3.0kb BamHⅠ片断产生的 DNA 带

答: 图 A15.2 是 BamHI 片段的限制性图谱。倒装法绘图是同样有效的,制作这种图谱的一种方法如下:画一条适当长度的线段表示 3.0kb 的 BamHI 片段,由于 HpaⅡ只切割一次,HpaⅡ的位点可以明确地定位,从片段的任一端起 1.6kb 处标出其位置。EcoRI 切割片段两次, 如 果你从片段的任一端起 1.7kb 处确定 EcoRI 位点的位置, 你会发现它与 HpaⅡ的距离同那些用双酶消化所得到片段的大小不相符, 因此 1.7kb 的片段必定位于中间,两个 EcoRI 位点必定离两端各为 0.4 和 0.9kb。

第三章

DNA 和 RNA 合成修饰酶

一、填空题 1.连接酶(ligase)是一类用于核酸分子连接形成——键的核酸合成酶,有 DNA 连接酶 RNA 连接酶之分。 2.原核生物主要有两种类型的 DNA 连接酶:E.coliDNA 连接酶和 T4DNA 连接酶。基因工程中使用的主要是 T4DNA 连接酶,它是从 T4 噬菌体感染的 E.coli 中分离的种单链多肽酶,分子量为——』Oa,由 T4 噬菌体基因——编码。E.coli DNA 连接是由大肠杆菌基因一编 码,也是一条多肽链的单体,分子量为 同,TDNA 连接酶用 T4 DNA 连接酶的 4.DNA 聚合酶 I 是 , kDa。这两 DNA 连接酶有两个重要的差异:第一是它们在催化反应中所用的能量来源不 作为能源。第是它们催化平末端连接的能力不同,在正常情 而 E.coli DNA 连接酶则用 。 。 合酶。该酶由大肠杆菌基因 编码, 是 在 1965 年从大肠杆菌细胞中分离的,所以又称为

况下只有 T4DNA 连接酶能够连接平末端 E.coliDNA 连接酶则不能。即使是调整反应条件,E.coli DNA 连接酶催化平末端连接效率也只有 3.DNA 连接酶的单位通常用 Weiss 单位表示,一个 Weiss 单位是: 一种单链球蛋白,分子量为 109kDa,酶蛋白中含有一个 Zn 原子。 5.T4 DNA 聚合酶与 Klenow 酶一样,具有 5’→ 3’,聚合酶和 3’→ 5’外切酶两种性,但是它的 3’→ 5’外切酶的活性比 Klenow 酶强 倍。该酶的 3’→ 5’外切活性既能作用于单链 DNA 也能作用于双链 DNA,不过作用于 6. 反向转录酶(reverse transcriptase)是由 kDa 和 7.从小牛胸腺中分离纯化的末端转移酶催化的基本反应是将 要引物,单链 DNA 是最好的引物单链 DNA 受体的长度最短需有 二价离子和 DNA 末端状态对催化反应影响较大,但是用 为辅助离子,可以催化任何形式的末端(突出的、隐含的、平齐的)加接单核苷酸,但突出的 3’端效率较高。以 Mn2 只能在单链 DNA 或双链 DNA3’突出端加尾。 8.S1 核酸酶(S1 nuclease)是从米曲霉(Aspergillus oryzae)中分离纯化的一种含 10. 金属蛋白,分子量为 32kDa,是一种耐热的酶(37—65%)。 ; 在 45~C 时, 。 。 9. 在 S1 保护实验中,S1 切割的温度有两种:20℃和 45℃,这是因为:在 20℃时, 技术可以用来鉴定 DNA 分子中与 DNA 结合蛋白相互作用的特定序列。 ,而连接酶Ⅱ则参与 中可能有作用。 的活性。 ;(4) 外,还需要 。 。 。 。 和 。 端脱磷酸。 最高, 最低。 端脱磷酸;另一种是 56℃,适用于 编码,作用是不需要模板。它在体内的作用是参与 11.真核生物有两种 DNA 连接酶,连接酶 I 主要是参与 T4 噬菌体 (1) (1) ;(2) ,它不参与 DNA 合成的连接,但在 ;(2) ; (3)
2+


的活性要强于

链。 ,但需

kDa 两个单位组成的二聚体, 作用时以 RNA 为模板合成 DNA。 ,同时释放出离的无机磷。催化反应时不需 个 dNTP。具有 3,突出末端的双链 DNA 是较好的反应底物。 /Mg 2+ 作为辅助因子,

12.T4RNA 连接酶是 1972 年发现的,并于 1977 年纯化。该酶是由 T4 噬菌体基因 13.DNA 聚合酶 I 的 Klenow 大片段是用

切割 DNA 聚合酶 I 得到的分子量 76kDa 的大片段,具有两种酶活性:

14.反向转录酶除具有以 DNA 和 RNA 为模板合成 DNA 的 5’→ 3’合成酶的活性外,还具有 4 种酶的活性: 15.RNA 连接酶作用时除了需要 ATP 和 Mg

16.DNA 聚合酶 I 是一种单体酶,分子量为 109kDa,它含有金属离子 17.为了防止 DNA 的自身环化,可用——脱去双链 DNA 18.T4 单核苷酸激酶进行 DNA 片段的 5’端标记时,主要是通过两种反应即 19.CIP 催化脱磷酸时有两种最适温度,一种是 37℃,适用于 21.EGTA 是 22.测序酶是修饰了的 T7 DNA 聚合酶,它只有 23.切口移位(nick translation)法标记 DNA 的基本原理在于利用 25.反转录酶除了催化 DNA 的合成外,还具有 一、填空题 离子螯合剂。

20.λ外切核酸酶可从双链 DNA 的 5’端依次切下 5’单核苷酸,但对不同末端的底物来说,作用效率不同, 酶的活性,而没有 的 和 酶的活性。 的作用。 或

24.欲将某一具有突出单链末端的双链 DNA 分子转变成平末端的双链形式,通常可采用 的作用,可以将 DNA/RNA 杂种双链中的

。 水解掉。

1.磷酸二酯。2,68;30;51;74;ATP;NAD;1/100。3.在 37℃下 20 分钟内催化焦磷酸交换 1nmol 32p 到 ATP 所需要的酶量 4.A.Komberg;Komberg;polyA。5.200;单;双。6.62;94。7.脱氧单核苷酸添加到 DNA 的 3’—OH 端;模板;3;C02+ 8.锌。9.S1 核酸酶只切割 DNA-RNA 双链中的环出结构;S1 核酸酶不仅切割环出部分,也能切割与环出的相对链 10.DNA 足迹。11.DNA 的复制;DNA 的修复。12. 63;尾丝的装配; tRNA 的修复 13. 枯草杆菌蛋白酶;(1)5’→ 3’合成酶的活性;(2)3’→5’外切核酸酶 14. (1)5’→3’外切核酸酶活性;(2)3’→5’外切核酸酶活性;(3)DNA 内切核酸酶的活性(Mn2+,切割 SC DNA); (4)解旋酶的活性 15. -SH。16. Zn。17. 碱性磷酸酶;5’端的磷酸基团。18. 交换反应;向前反应。19. 5’突出端;平末端和突出的 3’端 20. 5’突出末端;3’突出末端。 21. Ca2+。 22. 5’→3’合成; 3’→5’外切。 23. DNA 聚合酶 I:5’→3’外切核酸酶:5’→3’合成酶。24. S1 核酸酶切割;DNA 聚合酶补平。25. 核酸水解酶 H;RNA。

二、判断题 1.T4DNA 连接酶和 E.coli 连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接。 2.T4DNA 连接酶和 E.coli 连接酶都能催化双链 DNA 和单链 DNA 的连接。 3.反转录酶能够以单链 RNA 或单链 DNA 为模板,在引物的引发下合成一条互补的 DNA 链。以 RNA 为模板合成的 DNA 是互补 DNA(complementary DNA,cDNA)。若是以 DNA 模板合成 DNA,dNTP 的掺人速度很低(约 5 个核苷酸/秒),比 T7DNA 聚合酶的合成速 度差不多低 100 倍。 4.以 RNA 为模板, ,用反转录酶可同时产生单链和双链的 cDNA,双链 DNA 是由自身引物引导合成。但这种自身引物引导的合成效率远 低于外加寡核苷酸引物引导的合成。 5.Bal31 核酸酶(Bal31nuclease)是 Ca2+依赖性的,在反应混合物中加入 EDTA 便可抑制它的活性。 6.λ外切核酸酶不能在双链 DNA 的 gap 和 nick 处切割 DNA。 7.当一个 DNA 结合蛋白同它识别的核苷酸序列结合以后,就保护了它们的磷酸二酯键免遭切割,其结果,电泳胶上就有明显可见的空缺带 (与对照相比),这就是 DNA 足迹法。 8.T4DNA 连接酶和 E.coli 连接酶作用时都需要 ATP 和 NAD+作为辅助因子。 9.多核苷酸激酶之所以能够用于 DNA 片段的标记,是因为它能够将单个的 32 P 标记的单核苷酸加到每一 DNA 链的 5’端。 10.在反转录过程中,使用 AMV 比使用 M-MLV 可得到较多的产物。 11.真核生物可能有两种 DNA 连接酶,连接酶 I 和连接酶Ⅱ都能在 DNA 合成和连接中起作用。 12.DNA 聚合酶 I 有三种酶活性,其中 3’→ 5’ 外切核酸酶的活性在较多的 dNTP 存在下,常被 5’→ 3’合成酶的活性所掩盖。 13.用同一种酶切割载体和外源 DNA 得到黏性末端后,为防止它们自身环化,要用 CIP 将它们脱磷酸。 14.λ外切核酸酶的作用产物可以作为末端转移酶的作用底物。 15.用外切酶Ⅲ作系列缺失突变时,可以从突出的 3’端开始。 16.nick 和 gap 的含义是不同的,前者指 DNA 的单链中有较小的缺失,后者仅是断开了一个磷酸二酯键。 判断题答案: 1. 错误。E.coli 连接酶不能催化平末端连接。2. 错误。都不能催化单链 DNA 的连接。3. 正确。4. 正确。 5. 错误。加入 EGTA 可抑制活性,因为 EGTA 是 Ca2+螯合剂。6. 正确。7. 正确。8. 错误。前者需要 ATP,后者需要 NAD+。 9. 错误。 将 ATP 上的 32p 加到 5’端。 10. 错误。使用 M-MLV 反转录酶比使用 AMV 反转录酶得到较多的产物。原因是 AMV 反转录酶的 RNase H 的活性较 M-MLV 反转录 酶高,所以在以 mRNA 为模板的反转录过程中,使用 AMV 反转录酶,模板被降解得快,所以得到的产物较少。 11. 错误。DNA 连接酶 I 主要是参与 DNA 的复制,而 DNA 连接酶Ⅱ则是参与 DNA 的修复。 12. 正确。 13. 错误。载体和外源 DNA 不能同时脱磷酸,一般将载体 DNA 脱磷酸。 14. 正确。 15. 错误。不可以从突出的 3’端开始,只能从突出的 5’端开始。 16. 错误。正好相反,nick 是断开了一个磷酸二酯键,gap 指 DNA 的单链中有较小的缺失。 三、选择题(单选或多选) 1.T4DNA 连接酶是从 T4 噬菌体感染的 E.coli 中分离的,这种连接酶( (a)催化连接反应时既能以 ATP 又能以 NAD 作为能量来源 (c)是一种单肽酶,分子量为 74kDa ) (b)既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接 ) (b)作用时不消耗能量

(d)既能催化单链 DNA 连接又能催化双链 DNA 连接

2.DNA 连接酶在体内的主要作用是在 DNA 复制、修复中封闭缺口,( (c)需要 Mn2+等二价辅助离子 (a)T4DNA 聚合酶 4.末端转移酶是合成酶类,( (a)作用时不需要模板


(a)将双链 DNA 分子中的 5,磷酸基团同 3,-OH 末端重新形成磷酸二酯键 (d)也可以连接 RNA 分子 ) (b)Klenow 酶 )


3.在长模板链的指导下引物延伸合成长的 DNA 互补链时应选用(

(c)大肠杆菌 DNA 聚合酶 I

(d)T7DNA 聚合酶

(b)在 C02 的存在下,可以在突出的 3’末端延长 DNA 链 (d)上述说法有两种是正确的 (c)具有核酸酶活性 (d)用于体外标记 RNA 探针。 (d)上述说法都正确 )是不正确的。

(c)在 C0 2 的存在下,可以在隐蔽的 3,末端延长 DNA 链 5.在以下关于噬菌体 SP6RNA 聚合酶特性的描述中,( (a)能够特异性识别 SP6 启动子 (a)防止 DNA 的自身环化 (a)需要 ATP 作辅助因子 8.下列酶中,除( 6.在基因工程中,可用碱性磷酸酶( 7.从 E.coli 中分离的连接酶: ( )

(b)可能在 DNA 模板的切口(nick)处停止

(b)同多核苷酸激酶一起进行 DNA 的 5,末端标记 ) (b)需要 NAD 作辅助因子 )

(c)制备突出的 3,末端

(c)可以进行平末端和黏性末端连接 (b)外切酶Ⅲ (c)单核苷酸激酶 (c)反转录酶

(d)作用时不需要模板 (d)碱性磷酸酶

)外都具有磷酸酶的活性

(a)λ核酸外切酶

9.下列哪一种酶作用时需要引物? (

(a)限制酶 (b)末端转移酶

(d)DNA 连接酶

10.EDTA 是一种螯合剂,可以抑制大多数酶的活性,但在下列酶中,( (a)外切酶Ⅲ (b)EcoRI ) (c)Bal31 核酸酶 (a)切割双链的 DNA (d)PstⅠ 11.S1 核酸酶的功能是(

)不受它的影响 (c)切割发夹环 (b) 3’→ 5’外切酶
2+ 2+

(b)切割单链的 RNA )的活性。 (a) 5’→ 3’合成酶

(d)以上有两项是正确的 (c) 5’→ 3’外切酶 (d) 转移酶

12.Klenow 酶与 DNA 聚合酶相比,前者丧失了( 13.用 Bal31 核酸酶作系列缺失突变时,( (a)限制性内切核酸酶切除 15.λ外切核酸酶:( 16.T4RNA 连接酶: ( ) (a)作用时不需要模板 14.在 cDNA 技术中,所形成的发夹环可用( )

) (a)缺失从一端开始 (b)需要 Mg

作辅助因子 (c)需要 Ca 作辅助因子 (d)以上有两项是正确的 (d)用 5’外切核酸酶切除 (d)可以从 gap 部位降解 DNA (d)是 1967 年发现的 (d)平末端 DNA (d)Bal31 核酸酶

(b)用 3’外切核酸酶切除 (b)可以从 3’末端降解 DNA ) (a)作用时不需要模板 )

(c)用 S1 核酸酶切除

(c)可以从 nick 部位降解 DNA (b)作用时需要模板

(c)是 1972 年发现的

17.下列 DNA 不是λ外切核酸酶作用底物的是( (a)具有 3’突出端的双链 DNA 18.可以在切口部位起作用的酶是( 择题(单选或多选)答案: 1.b; 11.d; 2.a; 12.c; 3.d; 13.c; 4.C; ) (a)

b)具有 5’突出端的双链 DNA S1 核酸酶 (b)外切酶Ⅲ 7.b;

(c)切口 DNA (c) λ外切核酸酶 9.C; 18.a

5.C;6.a,b;

8.a;

10.c;

14.c;

15.a; 16.a,c;

17.C;

四、简答题 1. 按适当的顺序,列出将一种 mRNA 的 cDNA 克隆到表达载体所用到的酶。 答: (1) 反转录酶以 mRNA 为模板复制出单链 cDNA; (2) DNA 聚合酶以单链 cDNA 为模板合成双链 DNA; (3) S1 核酸酶切割双链 DNA 形成平末端; (4) 用限制性内切核酸酶切割载体; (5) 用 DNA 连接酶将 cDNA 插入载体中。 2. 为什么反转录酶在聚合反应中会出错? 答: 由于反转录酶缺少在 E. coli DNA 聚合酶中起校正作用的 3’→ 5’外切核酸酶活性, 所以聚合反应往往会出错, 在高浓度的 dNTP 和 Mg2+ 下,每 500 个碱基中可能有一个错配。 3. 什么是测序酶(sequenaseTM)? 答:所谓测序酶即是修饰了的 T7 DNA 聚合酶,是采用缺失的方法,从外切核酸酶结构域中除去 28 个氨基酸,这样使 T7 DNA 聚合酶完全 失去了 3’→ 5’的外切核酸酶活性,只有 5’→ 3’聚合酶的活性,而且聚合能力提高了 3~9 倍,测序时常用此酶。 4. 什么是 S1 核酸酶作图? S1 核酸酶作图是一种对 RNA 转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。 因为 BAP 耐热和耐酚抽提。 5. 基因工程中,为什么不喜欢用 BAP 来脱去 DNA 的 5’端的磷酸基团?

6. RNaseA 和 RNaseH 在催化活性和应用上有何不同? RNaseA 切单链 RNA,RNaseH 切 DNA-RNA 中的 RNA。 7. 切口移位标记 DNA 前,用 DNaseI 处理 DNA 时,应注意什么? 应注意 Mg2+离子浓度和处理时间及温度。 8. 核酸酶与外切核酸酶Ⅲ用于系列缺失突变有什么不同? Bal31 核酸酶是对称缺失,而外切核酸酶Ⅲ是不对称缺失。 五、问答题 2.简述 DNA 和 RNA 连接酶的催化反应机制。 答: 所有已发现的 DNA 连接酶以及 RNA 连接酶在作用过程中都形成两种以共价键相接的中间产物,即: (1)酶与 AMP 的络合物(E-A);(2)底物与 AMP 的络合物(DNA-A)。 催化反应分三步进行: ① 酶—核苷酸中间产物的形成:将 NAD 或 ATP 的腺苷酰基团转到连接酶的赖氨酸残基的ε-NH2 上形成酶—核苷酸中间产物,如果辅助因 子是 NAD’,另一个产物就是 NMN,若是用 ATP 作为辅助因子,另一个产物就是 PPi; ② 腺苷酰基团被转移到 DNA 末端的 5’-P,将 DNA 缺口的 5’端激活; ③ DNA 缺口的 3’-OH 同激活的 5’-P 形成磷酸二酯键,释放出 AMP。 3.影响 DNA 连接酶催化连接反应的因素有哪些? 答:黏性末端链通常以 12℃~15℃最好,这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火,低于上述温度会降低 连接酶的活性。平末端连接以室温为宜,因为平末端连接不存在 DNA 的退火问题,但是温度高于 30℃,连接酶特别不够稳定。平末端连接 时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高 10~100 倍。DNA 中有残存的 tRNA 不会抑制 DNA 连接酶的活性,但是,如果 NaCl 的浓度高于 150mmol/L,则对连接反应有强的抑制作用。 另外反应体系中有 NH4+离子的存在,对 E.coli DNA 连接酶具有激活作用 E.coliDNA 连 接酶需要 NAD+作辅助因子,而 T4DNA 连接酶需要 ATP。 4.什么是 Klenow 酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用? 答: Klenow 酶是 1974 年 Klenow 用枯草杆菌蛋白酶水解 DNA 聚合酶 I,得到两个片段,其中大片段的分子量为 75kDa,它具有 5’→ 3’ 聚合酶和 3’→ 5’外切核酸酶的活性,小片段具有 5’→ 3’外切核酸酶活性。 Klenow 酶主要有下列用途:

(1)修复反应,制备平末端(2)标记 DNA3’突出末端(3)其他的一些用途:包括用双脱氧末端终止法进行 DNA 序列分析、用于 cDNA 第二链的 合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链 DNA 探针等。 5.如何利用 T4DNA 聚合酶制备 3’隐含末端或双链平末端? 答: T4DNA 聚合酶具有 5’→ 3’聚合酶和 3’→ 5’外切核酸酶两种活性,在无 dNTP 时, 该酶只有 3’→ 5’外切核酸酶活性;如只有一种 dNTP(如只有 dATP), 链的 3’端的降解则到出现该碱基(A)为止。 这可使降解反应得到控制, 产生一定长度的 3’隐含末端; 当有 4 种 dNTP(且 浓度较高)时,则产生 3’平末端的 DNA。无论是降解还是合成反应,都是两侧同时进行。 6.如何利用 T4DNA 聚合酶进行双链 DNA 的 3,末端标记? 答:首先利用 T4 DNA 聚合酶的 3’→ 5’外切核酸酶的活性在缺乏 dNTP 的条件下切割双链 DNA,产生突出的 5’末端,然后加入放射性标 记的 dNTP,利用 T4DNA 聚合酶的 5’→ 3’合成酶的活性进行填补合成,得到两端的 3’端都是标记的双链 DNA 分子。如果被标记的双链 DNA 中有限制性内切核酸酶的切割位点,则可以得到两段放射性标记的探针。 7.如何利用 T4DNA 聚合酶制备平末端? 答:可用 T4 DNA 聚合酶将任何形式的双链 DNA 转变成平末端的双链 DNA。虽然 Klenow 酶能够进行这种反应,但是 T4DNA 聚合酶是 更好的选择,因为 T4DNA 聚合酶的 3’ → 5’外切核酸酶的活性比 Klenow 酶强得多,并且在高浓度的 dNTP 存在时,降解作用即会停止。 根据这样一种特性, 可以调整反应条件, 用 T4DNA 聚合酶的 3’ → 5’外切核酸酶的活性将具有 3’突出末端的双链 DNA 切成平末端; 用 T4 DNA 聚合酶的 5’→ 3’合成酶的活性将具有 5’突出末端的双链 DNA 填补成具有平末端的双链 DNA。 8.反转录酶有两种类型,一是来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMV,avian myeloblastosisvirus),另一种来源于鼠类莫洛尼氏白血病毒 (M-MLV,Moloney murine leukemia virus),它们之间有什么不同? 答: (1)AMV 反转录酶是一个二聚体(α=62kDa, β=94kDa), 具有 5’→ 3’合成酶和很强的 RNase H 的活性。 M-MLV 反转录酶是一条多肽链, 分子量为 84kDa 具有 5’→ 3’合成酶和较弱的 RNaseH 的活性。当用长的 RNA 合成互补的 cDNA 时,这种较低的 RNase H 活性很有利。 反应开始时, 引物与 RNA 模板形成的杂交体正是 RNaseH 的底物, 故 cDNA 合成一开始就存在 mRNA 模板降解和 DNA 合成起始之间的相 互竞争。另外,如果反转录酶在合成过程中暂停作用,RNaseH 就会在 DNA 链 3’末端附近切割 mRNA 模板,因此禽酶的高 RNase H 的活 性会影响 cDNA 的产量和长度。 (2)在反应温度上,AMV 反转录酶为 42℃,M-MLV 则是 37℃。鼠酶在 42℃下会迅速失活,因此对复制富含二级结构的 RNA 来说,使用 禽酶的效率高于鼠酶。但要注意,禽酶制品中常含有切割 DNA 的内源核酸酶活性。 (3)反应的最适 pH:AMV 反转录酶为 8.3,M-MLV 反转录酶为 7.6。两种酶对 pH 都非常敏感,即使误差为 0.2,反应产物也会大大缩短。 由于 Tris 缓冲液的 pH 值随温度而变化,因此在实验中必须校正 pH 值。 (4)DNA 内切核酸酶的活性:在 Mn2+存在时,AMV 反转录酶能够切割单链 DNA, 这种活性无专一性位点,对热稳定。而 M-MLV 反转录 酶没有此活性。 9.与 E.coliRNA 聚合酶相比,细菌噬菌体的 SP6RNA 聚合酶、T7RNA 聚合酶和 T3 RNA 聚合酶具有哪些优越性? 答: 首先,它们是非常高效的酶,可获得长度为几千个碱基的转录物; 第二是转录速度快,2μg 模板 DNA,在 30 分钟之内能够合成出 60μg 的转录物; 第三是起始转录的启动子序列非常特异,这对于进行链特异的放射性 RNA 探针的标记非常有利; 第四,目前纯化的 T3 和 T7RNA 聚合酶是从过量表达的细胞中分离的,价格便宜,比活性高。 10.什么是多核苷酸激酶的向前反应和交换反应? 答: 多核苷酸激酶能够把 ATP 的γ-P 转移到 ssDNA、dsDNA、ssRNA 或 dsRNA 分子的 5 ’-OH 端上。反应的方式有两种: (1)向前反应(forward (2)交换反应(exchange reaction) reaction) 若 DNA 的 5’端是羟基,激酶直接将 ATP 的γ-P 转移到 DNA 的 5’-OH 末端。 如果 DNA 的 5’端是 P 的话, 则该反应需分两步走, 首先在过量的 ADP 存在下, T4 多核苷酸激酶将磷酸化的 DNA5’末端磷酸转移到 ADP 上,然后再从[γ-32p]ATP 上将标记的γ—P 转移到 DNA 链上,使其重新磷酸化。 11.细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途? 答:主要差别是:CIP68℃时失活,而 BAP68℃稳定,且耐酚抽提。应用: (1)dsDNA 的 5,端脱磷酸,防止 DNA 的自身连接。但是用 CIP 处理后,最好将 CIP 除去后,再进行连接反应。 (2)DNA 和 RNA 脱磷酸,然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。 12.λ外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用? 答: λ外切核酸酶是从丸噬菌体感染的 E.coli 中分离纯化的,能够从双链 DNA 上依次切下 5’单核苷酸,作用底物是双链 DNA 的 5’ 磷酸末端,不能切割羟基化 5’端。该酶虽然能切割单链 DNA,但效率较低(下降 200 倍)。不能切割带切口或缺口的 dsDNA。该酶作用时是 行进性的,一步一步进行的。在基因工程中主要用于除去双链 DNA 突出的 5’末端,以便让末端转移酶加尾。 13.Mn2 答:


、Mg2 对 DNaseI(deoxyribonucleasel)的活性有什么影响?DNaseI 在基因工程中有什么作用?



DNaseI 是一种内切核酸酶,在 Mg 2+存在下,DNaseI 随机切割 DNA 两条链中的任意一条链;当 Mn2+代替 Mg2+ 时,DNaseI 几乎是

在双链 DNA 两条链相对的位置上打开缺口,使双链 DNA 断裂,产生的末端几乎是平末端或只突出 1~2 个核苷酸的 DNA 片段。 DNaseI 有许多用途:(1)在切口移位标记中,制造切口;(2)在足迹法中保护 DNA;(3)除去 RNA 制备物中的 DNA;(4)体外转录中除去 DNA 模板;(5)检测染色体中的转录活性区;(6)产生可在噬菌体 M13 载体上进行测序的随机克隆。 14.比较 S1-Mapping 和 Footprinting 在原理上、方法上、应用上海何不同? S1—作图(S1-mapping)和足迹法(footprintig)在原理上、方法上、应用上的差异列于 1:

第四章

质粒的分子生物学与质粒载体 、 、 。 DNA 的泳动速度 向的、或是 , OC DNA 泳

一、填空题 1. 基因工程中有 3 种主要类型的载体: 动速度 2. 由于不同构型的 DNA 插入 EB 的量不同, 它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同, SC 3. 质粒的复制像染色体的复制一样,是从特定的起始点开始的。然而,质粒的复制可以是 型质粒与松弛性质粒融合后,在正常情况下 必须具有低分子量。 5. 如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中,则属于 6. 质粒拷贝数是指细胞中 7. 复制子由三部分组成:(1) 8. 酵母的 2μm 质粒有 。 (2) (3) 。 。 ,它的氨苄青霉素抗性基因 ,可以配对形成哑铃结构。 ,它的四环素抗性基因来自于 恢复该基因的性状。 和 。 。 群,这是因为它们的 所致。 的复制起点可能被关闭。 、 、 。另外,一个理想的质粒载体

,L DNA 居中,通过凝胶电泳和 EB 染色的方法可将不同构型的 DNA 分别开来。 向的。在杂

种质粒中,每个复制子斑点都可以有效地加以使用。但是在正常条件下只有一个起点可能居支配地位。并认为:当某些具有低拷贝数的严紧 4. 就克隆一个基因(DNA 片段)来说,最简单的质粒载体也必需包括三个部分:

9. 一个带有质粒的细菌在有 EB 的培养液中培养一段时间后,一部分细胞中已测不出质粒,这种现象叫 10. pBR322 是一种改造型的质粒,它的复制子来源于 来自于 。 、

11. 粒的消失同染色体基因的突变是不同的,前者不能恢复,后者可以通过 12. ColEl 质粒复制的起始需要三种酶,即 13. YAC 的最大容载能力是 14. pSCl01 是一种 16. 转座子主要由下列部分组成:(1) 自 填空题答案: ,Amp 抗性基因则是来自 ;符号△表示 15. 把那些没有可检测表型的质粒称为 (2) 17. pUCl8 质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC 系列的载体是通过 。 。 18. 在基因型的表示中,符号表示 复制的质粒。 。 (3) ,BAC 载体的最大容载能力是

。 和 两种质粒改造而来。它的复制子来

1. 质粒 DNA;病毒 DNA;质粒和病毒 DNA 杂合体。2. 最快;最慢。3. 单;双;具有低拷贝数 4. 复制区: 含有复制起点;选择标记: 主要是抗性基因;克隆位点:便于外源 DNA 的插入 5. 同一个不亲和; 复制机制相同。6. 质粒的份数同染色体的比值,即质粒/染色体。7. (1)复制起点;(2)复制 IX;(3)复制终点 8. 两个 599bp 的反向重复序列。9. 质粒消除(或治愈)。10.pMB 1;pSCl01;pSF2124(R 质粒)。11.回复突变 12.RNA 聚合酶 I;DNA 聚合酶 I;RNase H。13.1000kb:300kb。14.严紧。15.隐蔽性质粒。 16.(1)反向重复序列;(2)转座酶;(3)标记基因。17.pBR322 和 M13;pMBl;转座子。18.插入;缺失 二、判断题 1.迄今发现的质粒 DNA 都是环状的。 2.线性质粒同环状质粒一样都不带有宿主必需的基因。 3.有 a、b、c 三个质粒,因为 a 和 b 能够共存于一个细胞,a 和 c 也可共存于同一个细胞,所以 b 和 c 一定能够共存于同一个细胞。 4. 插入元件(1S)也是一种转座元件,它除了有转座酶基因外,还有附加基因。 5. 如果两个不同的质粒可以稳定地共存于同一个细胞中,这两种质粒则属于同一个不亲和群。

6. 一个带有反向重复序列的双链 DNA 经变性后,复性时其单链可形成发夹环。 7. 能够在不同的宿主细胞中复制的质粒叫穿梭质粒。 8.任何一种质粒都可以用氯霉素扩增的方法,增加它的拷贝数。 9. 只有完整的复制子才能进行独立复制,一个失去了复制起点的复制子不能进行独立复制。 10.CsCl-EB 密度梯度离心法纯化 SC DNA 原理是根据 EB 可以较多地插入到 SC DNA 中,因而沉降速度较快。 11.质粒 ColEl 同 pSCl01 共整合后,得到重组质粒 pSCl34,具有两个复制起点,这两个起点在任何细胞中都是可以使用的。 12.pBR322 可以用于黏性末端连接、平末端连接和同聚物接尾法连接,无论用哪种方法连接,都可以用同一种酶回收外源片段。 13.所谓穿梭质粒载体是能够在两种以上的不同宿主细胞中复制的质粒,所用的复制起点不同。 14.一般情况下,质粒既可以整合到染色体上,也可以独立存在。 15.ColEl 是唯一用作基因工程的自然质粒载体,它具有四环素抗性标记,因而很容易选择。 16.某一染色体 DNA 经内切酶 Sal I 切割后,产生了若干个具有黏性末端的 DNA 片段,将这些片段分别在 T4 DNA 连接酶的作用下自身 连接成环,然后导入受体细胞,都可以进行独立地复制。 17.如果细菌的某种表型特征在 UV 处理下丧失后不再恢复,这种表型有可能是质粒赋予。 18.基因克隆中,低拷贝数的质粒载体是没有用的。 判断题答案: 1.错误。质粒也有线性的,如土壤中能够产生抗生素的链霉菌属的质粒。2.错误。线性质粒携带有编码宿主菌的主要表面蛋白基因。 3.错误。a 和 b 能够共存于一个细胞,说明 a 和 b 具有不同的复制机制;a 和 c 也可共存于同一个细胞,说明 a 和 c 具有不同的复制机制, 但是不能说 b 和 c 一定能够共存。因为 b 和 c 的复制机制有可能是相同的,也有可能是不同的。 4.错误。插入元件除了携带有与转座有关的基因外,不带有其他附加基因。5.错误。只有不同的不亲和群的质粒才能共存于同一个细胞中。 6.正确。7.正确。8.错误。并非所有的质粒都能用氯霉素进行扩增,如氯霉素抗性质粒就不能。9.正确。 10.错误。在 CsCl-EB 密度梯度离心中,EB 插入 SC DNA 的量较少,密度改变也较小,离心后停留在较高部位密度小的地方。 11.错误。一般使用质粒 ColEl 的复制起点。12.正确。13.正确。14.错误。一般情况下,质粒主要是独立存在。 15.错误。ColEl 上没有四环素抗性基因,不能通过抗性筛选。 三、选择题(单选或多选) 1.线性质粒复制的引物来自于( (a)细胞中合成的小分子 RNA ) (b)自身末端的端粒序列 (c)外加的寡聚 DNA )是不正确的 (b)可以在氯霉素作用下进行扩增 (d)自身断裂的小分子 DNA 16.错误。 只有含有复制子的片段重接后才能复制。 17.正确。 18.错误。对于那些有剂量限制的基因克隆需要使用低拷贝数的质粒载体。

2.下面关于松弛型质粒(relaxed plasmid)性质的描述中,( (c)通常带有抗药性标记 (a)pBR322 6.松弛型质粒: (b)pSCl01 ( )

(a)质粒的复制只受本身的遗传结构的控制,而不受染色体复制机制的制约,因而有较多的拷贝数 (d)同严紧型质粒融合后,杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子 3.基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的,真正的天然质粒载体很少,在下列载体中只有( (c)pUBll0 (d)pUCl8 (b)可以是某些蛋白的结合位点 (b)可用氯霉素扩增 ( ) (d)能产生肠杆菌素 ) (c)L DNA>OC DNA>SC DNA ) 5.反向重复序列:( ) (a)可以回折形成发夹结构

)被视为用作基因工程载体的天然质粒载体 (d)以上说法都不对

(c)参与转座子的转座

(a)在寄主细胞中拷贝数较多 (b)具有四环素抗性

(c)一般没有选择标记

(d)上述(a)、(b)两项正确

7.ColEl 是惟一用作基因工程载体的自然质粒,这种质粒: (a)是松弛复制型

(c)能被氯霉素扩增

8.同一种质粒 DNA,以三种不同的形式存在,电泳时,它们的迁移速率是:( (a)OC DNA>SC DNA>L DNA (b)SC DNA>L DNA>OC DNA )

(d)SC DNA>OC DNA>L DNA (c)pSCl01 (d)pUCl8

9.pBR322 是一种改造型的质粒,含有两个抗性基因,其中四环素抗性基因来自:( 10.关于质粒的相容性,下面哪一种说法不正确? ( (a)不同相容群的质粒能够共存于同一个细胞 11.关于穿梭质粒载体,下面哪一种说法最正确?( (a)在不同的宿主中具有不同的复制机制 (c)在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶 13.第一个作为重组 DNA 载体的质粒是( 选择题(单选或多选)答案: )

(a) ColEl (b)Ri 质粒

(b)质粒可以分成若干个不相容群,但不能分成若干个相容群 )

(c)如果 a、b 两种质粒不相容,说明它们的复制机制相同 (d)属于同一个不相容群中的质粒,不仅复制机制相同,且拷贝数和分子量也相同 (b)在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点 (d)在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率 ) (a)charomid (b)plasmid (d)pUCl8 (c)cosmid (d)phagemid (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01

12.能够用来克隆 32kb 以下大小的外源片段的质粒载体是(

1.b; 2.c; 3.b; 4.c; 5.a;6.d; 7.a,c,d; 8.b; 9.c; 10.d;1 l_b; 12.a; 13.c; 14.a,c,d,e 四、简答题 1.YAC 载体具有什么样的功能性 DNA'序列?为什么在克隆大片段时,YAC 具有优性?

答: YAC 带有天然染色体所有的功能元件,包括一个着丝粒,一个 DNA 复制起点,两个端粒。YAC 能够容纳长达几百 kb 的外源 DNA, 这 是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因,在染色体步移中每次允许更大的步移距离,同时能够减少完整基因组文库 所需的克隆数目。 2.列举质粒载体必须具备的 4 个基本特性。 (1)独立复制; (2)有选择标记; (3)有独特的酶切位点; (4)能转化但不扩散。 3.什么叫穿梭载体? 答:含有细菌质粒和克隆的真核生物 DNA 片段的杂种质粒,有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选 择的选择标记,所以,很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)乙 4.说明减少质粒和噬菌体载体上某种酶的识别位点的方法和原理。 答:质粒: 体外诱变或体内诱变(通过具有限制性作用的宿主)。 7.解释为什么不同的 Hfr 菌株具有不同的转移起点和方向? 答:不同 Hfr 株的 F 因子整合到细菌染色体中的位点及方向不同;F 因子的位置和方向决定了转移起点和方向。 8.怎样从一个 E.coli 的 Hfr 菌株中分离到一个 F ' gal 的菌株? 答:用一个 F 因子整合在最后被转移的 gal+ 基因附近的 Hfr 株,F- gal- 与 Hfr gal+ 杂交,30 分钟后中断,筛选含 gal+ 的接合体。在这种情况 下,只有含 gal+ 的接合体才是接收了 F’ gal+ 质粒的菌株,稀有的含 F’ gal+ 质粒的菌株是在 Hfr 群体中自发产生的。 9.你已经分离了一个新的 F’因子, 怎样用最简便的方法知道最初的 F 因子的部分 DNA 已经被切除,并被一个外源 DNA(也就是细菌 DNA)所替代? 答:分离 F 和 F’质粒并缓慢加热 DNA 使解离为单链,将变性的 DNA 混合,缓慢冷却,使 DNA 之间退火。有的双链分子是由 F 因子和 F’ 因子的 DNA 单链组成的杂交双链,电镜下可以看见非同源区为单链环(图 1)


噬菌体:体外诱变。

图1

F 和 P 质粒 DNA 杂交鉴定非同源区

10.你能用哪一种基因转移的方法确定 (1)E.coli 染色体上一个新发现的基因座在其染色体上的位置; 答:(1)Hfr 转化和中断接合; (2)转导。 五、问答题 1. 什么是复制子(replicon)? 答:复制子是能够进行独立复制的一种遗传因子。每一个复制子都含有一个与特定的 RNA 聚合酶结合的序列和 DNA 复制起始部位,即开始 复制的复制区。另外,复制子也包括一个复制的终止区。一个染色体可以是一个复制子(例如细菌的染色体),也可以含有多个复制子(如真核 生物的染色体)。一个失去了复制起点的 DNA 不能独立进行复制,但是,当它和另一个复制子连接起来时,就能在后者的带动下进行复制。 2. 什么是质粒的相容性?什么是不相容群?机制是什么? 答:质粒的相容性(compatibility)是指两种质粒是否可以共存于同一个细胞,如果能够共存则叫相容(又叫亲和),不能共存则称为不相容。从 本质上说,能够共存于同一个细胞中的质粒具有不同的复制机制,因而复制时互不于涉,并保持稳定。根据质粒的这一特性将质粒分为若干 个不相容群(incompatibility group)。同一个不相容群中的质粒不能共存于同一个细胞,因为它们的复制机制相同,因此凡能共存于同一个细胞 中的质粒属于不同的不相容群,因为它们的复制机制不同。 3. 什么是质粒的带动转移? 答: 质粒带动转移的转移作用(mobilization)是指由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程。带动转移型质粒由于缺少 10 个以上 合成纤毛所需的基因,因此,它们要转移的话,必须使用同一个细胞中由自主转移型质粒形成的纤毛。带动转移型质粒必须含有自主转移型 质粒的 oriT 位点, 因为自主转移性质粒的 tra 基因产物能够作用于任何质粒的 oriT 位点, 可带动转移的质粒也含有一些基因, 称为 mob 基因, 这些基因负责 DNA 的转移,并有一个 oriT 序列。这些基因位于称为 mob 的区域,并且与自主转移型质粒的 tra 基因相类似。产肠杆菌素质 粒 ColEl、ColE2 等就是非接合型质粒的例子。ColEl 的分子小(6.6kb)不足以编码全部转移体系所需的基因,因而不能够自身转移,但它具有 两个参与带动转移的基因:一个是 bom,另一个是 mob。 4. 说明变性定位法和限制性内切核酸酶定位法研究质粒复制起点的原理。 答:变性定位法(denaturation mapping)是根据环状双链 DNA 基因组中某些特异性区段比该分子上其他区段对热、碱、酶等变性因子有较高的 敏感性,而采用热、碱、酶等变性因子使环状 DNA 进行变性,结合电子显微镜技术,比较不同复制时间的复制区同变性部位的距离变化, 以确定环状双链 DNA 复制起点和方向的方法。用此法确定λ噬菌体的复制是一个起点、双方向对称复制。限制性内切核酸酶定位法是用限制 性内切核酸酶切割质粒 DNA,结合电子显微镜技术,比较不同复制时间的复制叉同两端距离的变化,以确定复制的起点和方向。用这种方法 确定了 ColEl 质粒复制是从离 EcoRI 切点的 17%的特异位点开始的,并从起点开始单向复制。 (2)一个新分离的突变在基因内的位置。

5. ColEl 衍生质粒拷贝数调节的机理是什么? 答:这类质粒的复制主要是通过一种由质粒编码的小分子的 RNA,称为 RNA I 的分子来调节。这种小分子的 RNA 主要是通过干扰另一种称 为 RNAⅡ的加工来抑制 DNA 的复制。质粒 DNA 复制的引物是由 RNAⅡ提供,在复制起始区,RNAⅡ同 DNA 形成一种 RNA-DNA 杂种分 子,RNAⅡ被 RNA 内切核酸酶 RNase H 切除,在 3’端形成一个羟基作为 DNA 聚合酶 I 催化的复制起始引物。RNAⅡ必需被正确地加工, 否 则不能作为复制起始的引物。RNA I 和 RNAⅡ是互补的,它们是由 DNA 双链的同一区域互补链合成的。正因为互补,这两种 RNA 就可以配 对形成双链的 RNA 螺旋,这种双链的 RNA 干扰了 RNAⅡ的加工,干扰了复制。用这种机制能够解释 ColEl 质粒是如何维持它的拷贝数的。 因为 RNA I 是由质粒 DNA 合成的,当质粒的浓度增高时,同时合成了较多的 RNA I。高浓度的 RNA I 干扰了大多数 RNAⅡ的加工,复制受 到抑制。当质粒的拷贝数达到每细胞 16 个时,这种复制的抑制作用几乎是完全的。除了 RNA I 外,质粒编码的一种蛋白质,叫作 Rop 蛋白, 协助维持拷贝数。 这种蛋白形成一个二聚体, 可以增强 RNA I 和 RNAⅡ的配对。 所以在 RNA I 的浓度相对低时引物的加工也受到抑制。 ColEl 质粒的复制的调节模式得到实验证明,这也是最早发现的反义 RNA 的调节作用。 8. 引起质粒不相容性的主要原因是什么? 答:质粒不相容性主要是由两方面的因素引起的:(1)由于复制控制而产生的不相容性。复制控制系统不能将它们作为两个质粒来识别,因而 只能随机选择进行复制;(2)由于分离引起的不相容性。如果两个质粒具有相同的 par 功能,这两个质粒有可能是不亲和的。当共存的质粒具 有相同的 par 功能时,在细胞分裂时只有一种能够被分配到子细胞。然而,有时一个子细胞只能得到一种类型的质粒,而另_个细胞得到另外 一种类型的质粒,这样得到的子细胞都是丢失了一种质粒的细胞。 9. 由于基因工程是人为改变遗传信息的操作,因此必须注意被操作基因的安全,进行严格的监控,质粒载体的安全性是十分重要的。请问 质粒载体的安全条件包括哪几个方面? 答:(1)非传递性和不被带动转移。对于多数基因克隆操作来说,都不希望载体能够进行自主传递,也不希望被带动转移。 (2)具有条件致死 突变, 如温度敏感质粒 pJC307(ColEl 的衍生质粒)在哺乳动物正常体温下就丧失复制能力, 可防止克隆基因扩散, 只存在于限定的宿主细胞中。 (3)一般情况下不希望与宿主染色体发生重组,因为重组后有可能给宿主带来突变。 (4)有较小的宿主范围。 11.自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多,即使是 ColEl 和 pSCl01 这两个自然质粒也不尽人意,通常需要进行改造,请问质粒改造 包括哪些基本内容? 答: 基本内容包括: (1)删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段, 削减载体的分子量, 使载体具有更大的容纳外源片段的能力。 (2) 加上易于选择或检测的标记。 (3)限制性内切核酸酶的酶切位点的改造,便于外源基因插入到载体中的特定位置。 (4)加上一些调控元件, 有 利于克隆基因的表达。 (5)安全性改造,限定载体的宿主范围。 14.有人用限制性内切核酸酶 EcoRl 分别切割松弛型质粒 ColEl 和严紧型质粒 pSCl01(各有一个切点),然后重组连接形成一个杂种质粒 pSCl34,请推测这种质粒有什么特性和用途。 答:由于 ColEl 不能在缺失 DNA 聚合酶 I 的细菌中复制,所以在这种细胞中就使用 pSCl01 的复制起点。而质粒 pSCl01 不能在不合成蛋白质 的细胞中复制,在这种情况下则使用 ColEl 的复制起点。一般情况下优先使用 ColEl 的复制起点。这种质粒由于具有两个复制起点,可以根 据需要,选用不同的宿主菌,表达特定的外源基因。 16.YAC 克隆载体常出现哪些问题? 答: (1)YAC 有嵌合现象,一个 YAC 中克隆的 DNA 片段可能来自两个或多个不同的染色体。在基因组文库中,嵌合体占克隆总数的 5%~ 50%。由特定的染色体构建的文库,嵌合体占克隆总数的 5%~15%。 (2)YAC 内部有重组现象,插入的 DNA 较大,序列发生重排,导致和原来染色体的序列不一 致,重组很难检出。 (3)YAC 还有缺失现象,影响 YAC 文库的代表性。 (4)YAC 结构和酵母天然染色体结构相似,使用常规方法不易将 YAC 和酵母天然染色体分开。 (5)构建好的 YAC 转化原生质化的酵母菌,转化效率低。 (6)建好库后保存方便,但要筛选某个基因时工作量大。

第五章

噬菌体载体 ; 二是 。

一、填空题 1.噬菌体之所以被选为基因工程载体,主要有两方面的原因:一是 2.第一个报道的全测序的单链 DNA 噬菌体是φX174,DNA 长 5386 个碱基对,共 特点是 3.λ噬菌体的基因组 DNA 为 期复制)则是按 的黏性末端部位就叫做 大不超过 kb。 和 、COS 位点序列来自 个,取代型为 (2) (3) 。 (2) 和 kb,后者为 (3) 。 kb。 的范围内。 。 。 ,最大的克隆片段达到 个。 (3) 。 kb。 。 kb,有 多个基因。在体内,它有两种复制方式,扩增时(早期复制)按 复制,成熟包装(晚 复制。它有一个复制起点,进行 位点。 kb,插入的外源片段最 向复制。丸噬菌体的 DNA 既可以以线性存在又可以环状形式存在,并且能够 个碱基组成的天然黏性末端。这种黏性末端可以自然成环。成环后 个 基因,为一环状 DNA 分子,基因组的最大

自然成环。其原因主要是在久噬菌体线性 DNA 分子的两端各有一个

4.根据噬菌体的包装能力,将野生型λ噬菌体的基因组 DNA 改造成插入型载体,该载体的最小分子大小约为 5.野生型的 M13 不适合用作基因工程载体,主要原因是 6.黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体,它的复制子来自 8.野生型的丸噬菌体 DNA 不宜作为基因工程载体,原因是:(1) 9. M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段:(1) 的,其中来自质粒的主要结构是 (2) ,而来自噬菌体的主要结构是

7.有两类改造型的λ噬菌体载体,即插入型和取代型。从酶切点看,插入型为

。10.噬菌粒是由质粒和噬菌体 DNA 共同构成

11.M13 单链噬菌体基因 2 和基因 4 之间的 IG 区有三个最重要的功能,即(1) 12.野生型的 M13 有 10 个基因,分为三个功能集团,其中与复制有关的两个基因是 13.以λ噬菌体载体和黏粒载体构建文库时,起始 DNA 的长度是不同的,前者为 填空题答案: 14.λ噬菌体载体由于受到包装的限制,插入外源 DNA 片段后,总的长度应在噬菌体基因组的

1. 它在细菌中能够大量繁殖,这样有利于外源 DNA 的扩增;对某些噬菌体(如λ噬菌体)的遗传结构和功能研究得比较清楚,其大肠杆菌宿 主系统的遗传也研究得比较详尽 2. 10;基因的重叠。 3. 48.5;60;凯恩斯模型; 滚环; 双;12; COS。 5. 没有合适的限制性内切核酸酶识别位点;选择标记。 8. (1)分子量大,(2)酶的多切点,(3)无选择标记。 二、判断题 1. 取代型载体(replacement vector)是指同一种限制性内切核酸酶在),DNA 中具有两个切点, 外源 DNA 通过取代这两个切点间的片段被克隆。 2. 现在最常用的 pUC 载体是 pUCl8,它的分子量小,具有多克隆位点和易于选择的分子标记,并且是松弛型复制。另外,这种载体可在辅 助质粒的帮助下合成单链 DNA。 3. 噬菌粒(phagemid)pUCll8/pUCll9 载体是集质粒和丝状噬菌体有利特征于一身的载体,既能合成单链 DNA,又能合成双链 DNA。 4. λ噬菌体 DNA 和 M13 单链噬菌体 DNA 在成熟前的 DNA 复制都是用滚环模型。 5. M13 噬菌体每个世代裂解宿主后,可释放 100 个子代噬菌体。 6. 以黏粒为载体的重组体虽然在平板上生长的速度不同,但是转化子中插入片段的扩增量是相同的。 判断题答案: 1. 错误。 不一定是同一种酶,如果两种不同的限制性内切核酸酶在载体上各只有一个切点,两切点间的片段被取代后又不影响噬菌体的生 活力,也是取代型载体。 2. 错误。 pUCl8 没有 IG 区,不可能形成单链。 3. 错误。如果没有助手噬菌体的存在,则不能形成单链 DNA。 4. 正确。 5. 错误。M13 噬菌体不会使宿主裂解,导致噬菌体从细胞释放出来。 6. 错误。由于重组体在乎板上生长的速度不同,转化子中插入片段的扩增量就不相同。 三、选择题(单选或多选) 1. 限制性内切核酸酶 EcoRI 在野生型的丸噬菌体 DNA 中有 5 个切点、Hind Ⅲ有 7 个切点,BamH I 也有 5 个切点。调整这些酶切位 点的数量,主要通过( 不正确的? ( ) (a) (c) ) (a)体内突变 (b)完全酶切后连接 (c)部分酶切 (b) (d)先用甲基化酶修饰后再酶切 利用这两个启动子的通用引物进行 PCR 扩增 2. PBluescript Ml3 载体在多克隆位点的两侧引入了 T7 和 T3 两个噬菌体的启动子, 这样增加了该载体的功能, 下述四种功能中哪一种是 可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析 利用通用引物进行序列分析 (d) 利用这两个启动子进行定点突变 (b) BAC 载体在细菌中以环形超螺旋状态存在,使分离操作起 11.(1)正链复制起点; (2)负链复制起点; (3)包装信号。 4. 36; 14 7. 1; 2 10.复制区; IG 区 14.75%一 105% 6. 质粒;丸噬菌体; 45。 12. 基因Ⅱ;基因Ⅴ。

9. (1)SS---~RF;(2)RF---~RF;(3)RF-*SS。

13.100kb;200kb。

3. 下面关于细菌人工染色体(BAC)的特征描述,除了( C )外都是正确的。 (a) 通过电激法将大质粒转化大肠杆菌比酵母的转化率提高了 10—100 倍 来相对容易 (c) BAC 载体在大肠杆菌宿主保持高拷贝 (d) 克隆到 BAC 载体上的外源片段可以直接进行测序以获得末端序列

4. 以黏粒为载体转染受体菌后,平板上生长的菌落会大小不一、生长速度不一的现象,其原因是( (a) (a) (c) (a) (c) 营养成分不足 (b) 重组后的质粒复制不稳定 (c) 重组后的黏粒整合到宿主染色体上 ) (b) (d) 5. M13K07 是一种辅助噬菌体 DNA,可用它帮助噬菌粒制备单链 DNA,这是因为( M13K07 能够进行滚环复制,得到大量的单链噬菌体 DNA M13K07 提供了成熟包装所需的信号 (d) ) (b) 它具有质粒 DNA 的复制特性 (d) ) 进入受体细胞后,可引起溶源化反应 M13K07 的 10 个基因都是正常的

) 重组体中插入片段的大小不同

M13K07 能够提供成熟包装的蛋白

6. 黏粒(cosmid)是一种人工建造的载体,( 进入受体细胞后,可引起裂解反应

它具有 COS 位点,因而可进行体外包装

7.Mu 噬菌体也是一种转座元件,这种转座元件( (a)可引起寄主的突变 8.关于 M13 的 IGIX,下列说法中哪一项不妥当?(

(b)可用于细胞内的基因工程 (c)具有转座酶基因 )

(d)以上说法都正确

(a) 具有正负链的复制起点 (b) 有噬菌体 DNA 被包装的信号 (c) 具有 150 个碱基的 AT 富集区(d) 有八个回文序列,可形成五个发夹环 9. M13 噬菌体基因组编码 10 个基因,在它的成熟过程中起调节作用的蛋白是( 选择题(单选或多选)答案: 1.a; 2.d; 3.c; 4.d; 5.d; 6.a,b,c; 7.d; 8.d; 9.b 四、简答题 1.在转导过程中,通常需要把受体菌和在供体中生长的噬菌体悬浮液分别铺在选择性培养基上,为什么? 答:这些平板起对照作用。第一个对照实验可检测和估计自发突变为野生型的频率;第二个对照实验确证噬菌体悬液中无菌情况 2.如何将野生型的九噬菌体改造成为一个理想的载体? 答: (1)削减分子量(除去非必需区和整合区); (2)削减酶切位点; (3)添加选择标记 (4)引入终止突变 3.用 Sal I 切割从噬菌体 J2 分离的 DNA 时,得到 8 个片段,分别是:1.3、2.8、3.6、5.3、7.4、7.6、8.1 和 11.4kb。但是,用 SaI I 切割 从被感染的寄主细胞中分离到的 J2 噬菌体 DNA 时,只得到 7 个片段,分别是:1.3、2.8、7.4、7.6、8.1、8.9 和 11.4kb,根据这些结果, 您得到哪些信息? 答: (1)J2 噬菌体是一种双链线性的 DNA 分子;(2)基因组全长是 47.5kb;(3)进入宿主后成环状;(4)5.3 和 3.6kb 的片段分别位于线 性 DNA 的两端。 4.在 cⅠ基因正常时为什么也会出现浑浊的噬菌斑?不正常则是清亮的噬菌斑? 答: 正常时,既有裂解途径也有溶源化途径。不正常则全部进入裂解途径。 5.λ噬菌体 DNA 被包装到噬菌体的头部,需要哪些基本条件?为什么? 答: (1)两个 COS 位点;(2)线性 DNA;(3)大小在丸噬菌体基因组的 75%一 105%的范围之内。 五、问答题 1.为什么野生型的λ噬菌体 DNA 不宜作为基因工程载体? 答: (1)噬菌体 DNA 没有容载能力,因为噬菌体的头部对 DNA 包装的量是有限制的,不能大于基因组的 105%,所以要将λ噬菌体改造成 载体,必须削减分子量。 (2)野生型的λDNA 对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点,不便于克隆。 (3)没有可供选择的标记。 (4)野生 型的λ噬菌体具有感染性,因此不够安全。 2.什么是蓝白斑筛选法? 答:这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段,携带有 lac 基因片段的λ载体转入 lac—的宿主菌后,在含有 5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插 入 lac(或 lac 基因部分被取代)后, 重组的噬菌体将丧失分解 X-gal 的能力, 转人 lac—的宿主菌后, 在含有 5—溴—4—氯—3—引哚—β—D— 半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。 3.蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性? 答:β—半乳糖苷酶的 N 末端是非必需的,可以进行修饰,并不影响酶的活性或。肽的互补性。如果插入的外源 DNA 引起。肽的可读框的 改变, 或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话, 就会形成白色噬菌斑。 如果插入 DNA 的碱基数正好是 3 的倍数, 或者插入的 DNA 中不含有终止密码的话,仍然会形成蓝色噬菌斑。这种插人物的长度可达几百个碱基对。M13 载体的这种性质可以用来检测和选择产生新的 终止密码或改变可读框,即移码突变。 4.什么是 c I 筛选法? 答:CⅠ基因的功能是促使噬菌体进入溶源化,但在正常情况下,它的噬菌斑是不清楚的,有点浑浊。这是因为在λ噬菌体感染时,有少数细 胞进入溶源化途径,这些细胞生长在噬菌斑中,就造成了噬菌斑浑浊。由于 cⅠ基因的产物——阻遏物的失活,不会有溶源菌的形成,因此, 形成的噬菌斑都是清亮的,很容易将重组体与非重组体区别开来。cI 阻遏物的名字就是指在该基因中插入一段 DNA 后会使噬菌斑的形态变 得清亮(c=clear)。 5.λ噬菌体载体具有哪些优点与不足? 答: 优点: (1)λ基因组中有 1/3 的非必需区, 可以被置换, 改造成载体后, 克隆的片段较大(可达 20kb), 而质粒载体的克隆片段只有几个 kb; ) (a)gp2 蛋白 (b)gp5 蛋白 (c)gp7 蛋白 (d)gp9 蛋白

(2)用噬菌体 DNA 作为载体,即使不进行体外包装,转染的频率也比质粒转化的效率高,包装后的效率就更高了; (3)λ可通过溶源化反应整 合到寄主染色体上,当不需要外源基因大量表达时,可让它以溶源性存在,若要表达,可通过诱导即可进入裂解途径,释放出大量的噬菌体, 得到的重组 DNA 的拷贝数就会很多。 不足: (1)需要包装比较麻烦,包装率又不稳定,购买包装蛋白的费用又高;(2)没有质粒的用途广泛。 6.什么是 M13 的 IG 序列区?有何特点和功能? 答:在 M13 基因组中的基因 2 与基因 4 之间有一个长度为 507 个核苷酸的基因区间,简称 IG(intergenic region),占基因组的 8%。该区 具有以下特点: (1)具有正、负链的复制起点; (2)具有噬菌体 DNA 被包装到噬菌体颗粒的包装信号; (3)具有 150 个碱基的 AT 富集区; (4)有 5 个回文序列,能够形成 5 个发夹环,回文序列 A 是包装信号。 IG 区在 M13 噬菌体的生命周期中的 4 个过程中起重要作用: (1)噬菌体 DNA 成熟包装到噬菌体颗粒中的包装识别位点;(2)RNA 引物合成的位点,合成的引物用于(一)链的合成; (3)(+)链合成的起始位点,全长 140bp,分成两个结构域,结构域 A 长为 40bp,是复制起始的基本位点,它被 gp2 识别,产生一个切口开始复 制,并作为复制的终止点。结构域 B 长为 100bp,起增强子作用,帮助 gp2 在结构域 A 起作用。 (4)(+)链合成的终止位点。 7.将野生型的 M13 改造成基因工程载体,首先是进行酶切位点的改造,请问 M13 中的 EcoRⅠ最初是如何引入的? 答: 用识别 4 个碱基的限制酶 HaeⅢ切割 M13 双链 DNA,发现 HaeⅢ在 M13 上有 10 个切点。为了将 M13 构建成克隆载体,首先用 HaeⅢ将 RFl 进行部分消化,使之产生单一切点的全长的线性 M13DNA。HaeⅢ在 M13 上有 10 个切点,因此产生的线性 DNA 的末端可 能是这 10 个切点的任何一个部位产生的。将外源 DNA 同线性的 M13DNA 连接起来,只有在非必需区插入并连接起来的重组体能够进行 复制,从必需区插入的重组 DNA 不能复制,因此将会被丢失。根据上述的原理,用 HaeⅢ部分酶切野生型的 RFMl3DNA,然后同 lac 插人 片段连接,感染后筛选重组体 M13mpl,该重组体中的插入片段是从 IG 区的 5868 位的 HaeⅢ位点插入的。通过对 lac 插入片段的序列分 析发现,只要将β半乳糖苷酶基因内的密码子 5 的碱基 G 换成 A 即可产生一个 EcoRI 的识别位点(G↓AATTC)。因为知道 G 中的 06 甲基化 将会导致 G 同 U 的配对, 将单链的 M13mpl 的(+)链用甲基化试剂 N—甲基—N—亚硝酸脲进行处理, 用突变的 DNA 去转染细菌, 分离 RF 型 DNA,由于分离的 RF DNA 并非都具有 EcoRI 位点的突变体,所以用 EcoRI 切割后,通过琼脂糖凝胶电泳进行检查,根据线性 DNA 与 环状 DNA 的电泳迁移率的不同,将线性化的 DNA 分离出来,重新连接成环,再进行转染。分离到三个克隆,每个克隆都有一个 EcoRI 的 位点,但所在位置有所不同,将它们分别命名为: M13mp2、M13mp3、M13mp4。 9.M13 系列载体具有哪些优缺点? 答:改造的置换型噬菌体载体,重组人外源片段之后,总体积不能超过λ基因组的 105%,不能少于λ基因组的 75%。以置换型λ噬菌体 DNA 作为载体,首先要分离左、右两臂同外源 DNA 重组。如果没有外源片段,仅是两臂连接,长度短于λ基因组的 75%,不能被包入噬菌体颗 粒,就不能感染寄主,也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后,总长度超过丸基因组 105%后,也不能包入噬菌体颗粒,自然不能形 成噬菌斑。 9.M13 系列载体具有哪些优缺点? 答:M13 克隆系统具有很多优点: (1)克隆的片段大:M13 噬菌体的 DNA 在包装时不受体积的限制,所以容载能力大,有报道,有些噬菌 体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体 DNA 长 6~7 倍的 DNA(插入片段可达 40kb)。 (2)可直接产生单链 DNA,这对于 DNA 测序、DNA 诱变、制备特异的单链 DNA 探针都是十分有用的。 (3)单链 DNA 和双链 DNA 都可以转染宿主,并可根据人工加上的选择标记进行筛选。 M13 克隆系列的不足:(1)较大的外源片段插入后,在扩增过程中往往不够稳定,一般说,克隆的片段越大,发生丢失的机率越大。 (2)单链载体分子感染的细胞中,往往是单链和双链混杂,分离双链比较麻烦。 10.黏粒载体具有哪些特点与不足? 答:主要特点有: (1)具有质粒复制子,进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制,并且能够被氯霉素扩增。 (2)具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记。 (3)具有λ噬菌体的包装和转导特性。 分子的载体自连,尽管如此,也不能被包装的,因为 COS 位点太多了。 黏粒载体也有如下不足: (1)如果两个黏粒之间有同源序列,可能会发生重组,结果会使被克隆的片段重排或丢失。 (2)含不同重组 DNA 片段的菌落生长速度不同,会造成同一个平板上菌落大小不一。另外由于不同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同, 会造成文库扩增量的比例失调。 (3)包装过程复杂,包装效率不稳定,代价高。 11.辅助噬菌体 DNA 和相应的噬菌粒是如何协同工作的? 答:虽然噬菌粒载体携带有 M13 的 IG 区,能够合成单链 DNA,但是它没有 M13 的功能基因,没有 M13 基因 2 的产物存在,所以不能 合成单链 DNA。而辅助噬菌体具有 M13 的所有功能基因,但是 IG 区是缺陷的,辅助噬菌体本身的 DNA 不能进行单链复制,于是就可以 为噬菌粒提供基因 2 产物和包装蛋白。辅助噬菌体必需具备如下条件: (1)辅助噬菌体的 DNA IG 区必需失去功能,其本身的 DNA 不会被包装到成熟的噬菌体颗粒中; (2)由于辅助噬菌体的 IG 区失活,其本身的基因不能表达,要使辅助噬菌体的所有功能基因都能进行表达,必须在辅助噬菌体的基因组中导 人新的复制起点; (3)辅助噬菌体的基因组中具有选择标记,便于识别和收集一定数量的辅助噬菌体。 (4)容载能力大。克隆的最大片段在 45kb,最小片段 为 19kb。 (5)简化了筛选。如果载体的分子量在 5kb 的话,得到的转导子几乎排除由载体自连的可能性,因为要被成功包装,至少要 7 个

第六章

DNA 的分离、合成与测序 。

一、填空题 1.不同的宿主细胞其核酸酶的活性是不同的,如细菌中的 HBl01 菌株及 JM 系列的宿主菌所含核酸酶的活性比 DHl、LE392 等菌株 2.SDS 是分离 DNA 时常用的一种阴离子除垢剂,它有四个作用: (1) (3) ; ; (2) (4) (2) 。 。另外,异戊醇有助于分相,使 (2) 。 。 (4) 最好。 。 。 ; 。

3.酚是蛋白变性剂,用酚抽提细胞 DNA 时,具有两方面的作用:(1) 离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 5.同其他水解蛋白酶相比,蛋白水解酶 K 具有两个显著的优点:(1) 6.在分离 DNA 时要使用金属离子螯合剂,如 EDTA 和柠檬酸钠等,其目的是

4.用酚—氯仿抽提 DNA 时,通常要在氯仿或酚—氯仿中加少许异戊醇。这是因为:异戊醇

7.用乙醇沉淀 DNA 时,通常要在 DNA 溶液中加入单价的阳离子,如 NaCl 和 NaAc,其目的是 8.浓缩 DNA 的方法有:(1) (2) (3) 9.通常可在三种温度下保存 DNA:4~5℃、-20℃、-70℃,其中以 为宜。 11.引物在基因工程中至少有 4 个方面的用途:(1) 隆 PCR 产物的 。 ,后者 ,后者则是根据 。 (2) (2) 法及 作用。 的技术称为 。 法等方法去除蛋白质。 。 (3) (2) (3) (4)

10.用于分离质粒 DNA 的细菌培养浓度达到 0.8×10 细胞/ml 时,即可通过离心收集菌体。收集菌体使用定角转子,离心的速度以 。

12.Clark 发现用 Taq DNA 聚合酶得到的 PCR 反应产物不是平末端,而是有一个突出碱基末端的双链 DNA 分子。根据这一发现设计了克 13.在用 SDS 分离 DNA 时,要注意 SDS 的浓度,0.1%和 1%的 SDS 的作用效果是不同的,前者 14.碱解法和清亮裂解法是分离质粒的两种常用的方法,二者的原理是不同的,前者是根据 15.在 DNA 分离过程中,通常要进行透析,其目的是 16.在分离质粒 DNA 的菌体培养过程中,加入氯霉素有两个好处:(1) 17.在 DNA 分离过程中造成 DNA 分子断裂的因素很多,主要有(1) 18.在分离 DNA 时,常用 法、 法、 19.在 DNA 保存液中,常加一滴氯仿,主要是起 20.按照人们的意愿,改变基因中碱基的组成,以达到 21.1955 年,英国剑桥大学的 22.可以用 除去 DNA 溶液中的氯化铯。 。 。 。 。 引物来合成相应的基因。 (2) 。 。 ,而柠檬酸钠的作用是 的活性及 。 。 作用。 ,从而使不同分子量的 DNA 分子得以分开。 。 。



第一个合成了具有 3’,5’—磷酸二酯键的 TpT 和 pTpT,为此获得了

年的诺贝尔奖。

23.在 cDNA 的合成中要用到 S1 核酸酶,其作用是切除在 24.在简并引物的设计中,常常要用到 dI(次黄嘌呤),原因是 25.在分离 DNA 时,要戴手套操作,原因是 26.乙醇沉淀 DNA 的原理是 27.简并引物 PCR 主要是根据蛋白质的氨基酸序列设计 28.超离心法纯化质粒 DNA 时,选用 CsCl 作介质的优点是:(1) 29.缺失突变的原理是缺失了 30.用核酸酶 Bal 31 作系列缺失突变,得到的产物是: 31.SSC 是由 NaCl 和柠檬酸钠组成的试剂,其中 NaCl 的作用是使 33.对于 HBl01 及其衍生株不宜用煮沸法分离质粒 DNA,其原因是 填空答案: ; 1.高。

32.在重蒸酚中加入 0.1%的 8—羟基喹啉及少量β—巯基乙醇,不仅可以防止酚的氧化,还可以

2.(1)溶解膜蛋白及脂肪,从而使细胞膜破裂;(2)溶解核膜和核小体,使其解聚,将核酸释放出来;(3)对 RNase、DNase 有一定的抑制作用; 3. (1)使蛋白质变性; (2)由于它能使蛋白质变性,故也能使核小体和核糖体解聚,释放出 DNA 和 RNA,提高 DNA 的得率 4. 是一种有机试剂,可以降低表面张力,从而减少气泡产生 5. (1)水解能力很强,作用范围广;(2)在 SDS 和 EDTA 中仍保持高活性,可以同 SDS 和 EDTA 同时使用 6. 整合 Mg2+离子,抑制核酸酶的活性。 7. 中和 DNA 分子的负电荷,增加 DNA 分子间的凝聚力 9. -70℃。 10.8000r/min 8. (1)包埋吸水法;(2)蒸发; (3)膜过滤法;(4)有机溶剂抽提法。

11.(1)合成探针;(2)合成 cDNA;(3)用于 PCR 反应;(4)进行序列分析。12.T—载体。 13.只将 RNA 分离出来;可将 DNA 与 RNA 一起分离出来。14.质粒与染色体的构型差异;质粒与染色体 DNA 分子量的差异 15.除去小分子的无机离子。 16.(1)可以扩增质粒 DNA; (2)抑制了菌体的数量,有利于裂解

17.(1)核酸酶降解;(2)化学降解;(3)物理剪切。18.酸变性;碱变性;热变性; 酶水解。19.抑制真菌污染的。20.基因突变;定点突变 21.Todd;1957。 22.透析法。23.第二链合成时形成的发夹环。24.dI 可以同任何碱基相匹配。25.手上常有核酸酶 26.乙醇使 DNA 分子脱水。27.一组混合。28.(1)CsCl 与不同 DNA 起反应;(2)CsCl 可以自动形成密度梯度 29.一段 DNA 后,造成了编码的改变,从而改变了表型(生理或生化表型)。30.平末端或是短的 5,突出端的 DNA 分子 31.DNA 溶解;作为螯合剂,抑制核酸酶的活性。32.抑制 RNase; 金属离子的螯合。33.释放大量的糖类 二、判断题 1.氯霉素扩增 DNA 时,加氯霉素的时间是重要的,因为加得太早,菌数不够,加入时间过迟,菌龄过老,容易自溶。 2.所谓引物就是同 DNA 互补的一小段 RNA 分子。 3.脉冲凝胶电泳采用一个很强的电场来分离非常长的 DNA 分子,其原理在于迫使 DNA 分子根据长度的不同而具有不同的速度,并按大小 顺序通过凝胶。 4.Agarose-EB 电泳法分离纯化 CCC DNA 原理是根据 EB 可以较多地插入到 CCC DNA 中,因而迁移速度较快。 5.如果 PCR 的每一次循环都把上一次循环中合成的 DNA 增加了一倍,那么,10 个循环就扩增了 1000 倍,20 个循环就扩增了 100 万倍, 30 个循环就扩增了 10 亿倍。 6.PCR 既能用于扩增任何天然存在的核苷酸序列,又能重新设计任何天然核苷酸序列的两个末端。因此,任意两个天然存在的 DNA 序列 都能快速有效的扩增,并拼接在一起。 7.最有效的制备纯 RNA 的方法是让其在细胞中超表达,然后提纯。 8.大量制备已被克隆基因编码蛋白产物的常用方法是体外转录和翻译。 9.通过报告基因与来自于目的基因上游和下游各种 DNA 片段的结合,研究基因的调控序列。 10.温度敏感突变型是非常有用的,在这些突变型中,可以通过对温度的改变控制这些突变体中异常表型的出现。 11.用人工合成的含有所需碱基变化的寡聚核苷酸,可以将特殊突变引入克隆的基因。 12.蛋白质的氨基酸序列中各种重要信号都可以通过短氨基酸序列同报告蛋白的融合进行研究。 13.简并引物是根据已知 DNA 序列设计的引物群。 14.在 DNA 贮存液中加一滴三氯甲烷,可防止真菌的污染。 15.密码的偏爱性是指不同种属的生物对简并密码具有不同的使用频率。 16.插入到质粒 DNA 中的 EB 可以用正丁醇抽提除去。 17.碱法和煮沸法分离质粒 DNA 的原理是不相同的。 18.酚法和碱法分离质粒 DNA 都要用溶菌酶破壁,但碱法用的溶菌酶的浓度要高。 判断题答案: 1. 正确。 2. 错误。引物可以是 RNA 或 DNA 分子。 3. 错误。 当 DNA 分子以 S 形通过凝胶时, 移动的速率与长度无关; 但在脉冲电场凝胶电泳中, 电场的方向呈周期性地变化, 这就迫使 DNA 分子改变方向后才能继续以 S 形的方式通过凝胶。分子越大,改变方向所需的时间越多,所以,较大分子的移动也就越来越慢。 4. 错误。EB 插人少,体积改变小,迁移快。 5. 正确。 6. 正确。 7. 错误。获得某一纯 RNA 的最好途径是:将编码该 RNA 9. 正确。 10.正确。 11.正确。 的 DNA 片段克隆到病毒 RNA 聚合酶有效识别的启动子下游,然后进行体外转录。 8. 错误。常用的方法是让蛋白质在细胞内过量表达,然后用常规方法纯化。 溶酶体的信号肽就是一个例子。 13.错误。简并引物是根据已知蛋白质的氨基酸序列设计的引物群。 三、选择题(单选或多选) 1.从细胞或组织中分离 DNA 时,常用蔗糖溶液,目的是:( (a)抑制核酸酶的活性 (a)30~50 (b)100~200 (b)保护 DNA,防止断裂 (c)300~400 (d)500—700 ) (a)脱三苯甲基反应 (b)偶联反应 (c)氧化反应 (d)封端反应 ) ) (d)有利于细胞破碎 ) (c)加速蛋白质变性 14.正确。 15.正确。 16.正确。 17.错误。碱解法、煮沸法纯化质粒 DNA 都是根据质粒和染色体 DNA 的变性和复性。 18.正确。 12.错误。蛋白质所携带的某些信号需蛋白质的正确折叠,以便让多肽链中相距较远的部分尽可能地靠近。引导溶酶体蛋白从高尔基体转向

2.不是所有松弛型质粒都需要进行扩增的,如 pBS、pUC 载体系统就不必进行氯霉素扩增,这是因为这些质粒的拷贝数很高,达到( 3.在亚磷酰胺化学法合成 DNA 中,影响产量的最关键步骤是:( 5.CsCl-EB 密度梯度离心法纯化质粒 DNA 的原理是:( (a)氯化铯可以较多地插入到线状 DNA 中 (c)EB 可以较多地插入到线状 DNA 中 6.关于 cDNA 的最正确的说法是:(
2+

(b)氯化铯可以较多地插入到 SCDNA 中 (d)EB 可以较多地插入到 SCDNA 中

) (c)以 mRNA 为模板合成的双链 DNA ) (d)以上都正确

(a)同 mRNA 互补的单链 DNA (b)同 mRNA 互补的双链 DNA (a)mRNA 会降解 (b)mRNA 会沉淀 (c)核糖体解体

7.在分离 mRNA 的溶液中,Mg 离子的浓度不能低于 0.5mmol/L,因为低了,( (d)mRNA 会变性

8.用碱法分离质粒 DNA 时,染色体 DNA 之所以可以被除去,是因为:( (a)染色体 DNA 断成了碎片 (b)染色体 DNA 分子量大,而不能释放 ) (a)偏爱性 9.下面哪一种特性不是密码所具有的? ( (a)只能将 DNA 抽提到水相 (a)溶液 I 的作用是悬浮菌体 12.异戊醇的作用是:( 13.松弛型质粒: ( (a)底物(模板)过剩 (a)dGTP (b)dATP ) ) (b)简并性

) (d)染色体未同蛋白质分开而沉淀 (c)重叠性 ) (d)DNA 和 RNA 都不能进入水相 (d)连续性

(c)染色体变性后来不及复性

10.用 SDS—酚抽提 DNA 时,SDS 的浓度是十分重要的,当 SDS 咖踱为 0.1%盹( (b)只能将 RNA 抽提到水相 ) 11.关于碱解法分离质粒 DNA,下面哪一种说法不正确?( (c)溶液Ⅲ的作用是使 DNA 复性

(c)可将 DNA、RNA 一起抽提到水相

(b)溶液Ⅱ的作用是使 DNA 变性 (d)质粒 DNA 分子小,所以没有变性,染色体变性后不能复性 (b)使 DNA 脱水 (c)帮助 DNA 进入水相 (d)减少气泡,促进分相 (d)只有(a)和(b)是正确的 (b)可用氯霉素扩增 (c)一般没有选择标记 (a)使蛋白质脱水

(a)在寄主细胞中拷贝数较多 (b)dNTP 的大量消耗 (c)dCTP (d)dTTP

14.关于 PCR 扩增停滞的原因有很多种,但下列各项中,(

)项不是主要原因。 (d)非特异性产物的竞争性抑制 )

(c)产物的聚集

15.Clark 做了一个有趣的实验,发现 Taq DNA 聚合酶可以不需要模板,在双链 DNA 的末端加一个碱基,主要是加( 16.在简并引物的 3’端尽量使用具有简并密码的氨基酸,这是因为( (a)Taq 酶具有一定的不精确性 (b)便于排除错误碱基的掺人 (b)氧化物会改变 pH 值 ) (c)易于退火 ) (d)易于重组连接

17.变色的酚中含有氧化物,这种酚不能用于 DNA 分离,原因主要是:( (a)氧化物可使 DNA 的磷酸二酯键断裂 选择题(单选或多选)

(c)氧化物同 DNA 形成复合物

(d)氧化物在 DNA 分离后不易除去

1.b;2.d;3.b; 4.b; 5.c;6.C; 7.C; 8.C; 9.C; 10.b;11.d; 12.d;13.d; 14.b; 15.b;16.a;17.A 四、简答题 1.PCR 反应包括引物与 DNA 模板链间的解链与复性。讨论循环温度范围对引物-DNA 双螺旋稳定性的影响及对 PCR 产率的影响。 答: 由于 GC 对之间是三个氢键的作用力, 比两个氢键作用力的 AT 对要稳定, 因此 DNA 的解链与退火都是依赖于 G+C 的含量与 A+T 的 含量的比例。GC 对普遍比 AT 对更倾向于非特异性的复性,所以 GC 含量高的引物比 AT 含量高的引物更适合于 PCR 反应。 2.Sanger 的双脱氧法测序的原理。 答: (1)以双脱氧的底物取代正常的 DNA 合成底物掺人到正在合成的新链上;(2)由于是双脱氧,将不能同下一个脱氧单核苷酸形成磷酸二 酯键,从而使合成终止。 3.分离 DNA 时,为什么要在缓冲液中加入一定浓度的 EDTA 和蔗糖? 答: (1)EDTA 是螫合剂,可同 Mg2+离子螯合,使核酸酶失去了作用的辅助因子,而被抑制活性; (2)蔗糖增加缓冲液的黏度,保护 DNA 不易断裂。 4.PCR 的基本原理是什么?用 PCR 扩增某一基因,必须预先得到什么样的信息? 答: (1)DNA 半保留复制的原理,在体外进行 DNA 的变性、复性和引物延伸。(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶 DNA 序列 5.说明合成接头在基因工程中的主要作用。答:帮助外源 DNA 插入、给载体添加酶切点、调整读码框等。 6.从细菌中分离总 DNA,应采取哪些措施获得高分子量的 DNA? 答:添加酶抑制剂抑制核酸酶活性,温和操作,加保护剂等 7.用酚抽提蛋白质时,离心后,为什么蛋白质总是会停留在水相和酚相之间? 答:酚使蛋白分子间脱水而变性,变性蛋白的密度比水大,但比酚小,故此停在中间 8.分离 pBR322 DNA 可考虑用氯霉素扩增,分离 pUCl8 质粒 DNA 则不必用氯霉素扩增,为什么? 答: pUCl8 的拷贝数可达 500—700,即使扩增到 3000,也只扩大 5—6 倍。但是,菌的生长时间至少减少 4~6 小时,按 20 分钟一代计 算,4 小时减少 12 代,由此可见,其质粒数不仅不能增加,反而会减少。 9.溶菌酶是破碎细菌细胞的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感,应该如何处理? 答:添加 DTT、β—巯基乙醇,或 8.0mol/L 的尿素等增加敏感性。 10.假定你从黏质沙雷氏菌中克隆了一个基因,并推测可能是依赖于锌的金属蛋白酶,因为它含有两个组氨酸和一个谷氨酸与锌形成锌指结 构。请你设计一个方案,改变其中一个组氨酸看看是否改变蛋白酶的活性? 五、问答题 1.用于克隆的 DNA 在质量上有什么要求? 答:(1)首先是稳定性:保持 DNA 的高分子量和原有的构型。(2)低蛋白质含量。 (3)DNA 样品中应不含 RNA (4)不含可透析的小分子 2.为什么从细胞中分离 DNA 时往往会断裂? 答:1)细胞内存在很高的核酸酶活性,DNA 裸露后,很容易遭到核酸酶的降解; (2)在分离 DNA 的过程中,要用到一些酸碱等化学试剂,也 会使 DNA 断裂; (3)在 DNA 的分离过程中要经过多次离心、吸取、转移等,产生的机械张力剪切会使 DNA 断裂。 3.为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于 DNA 的分离? 答:由于苯酚呈酸性,并且常常会氧化产生自由基,直接用于 DNA 的分离,会使 DNA 遭到破坏,所以,用前需要重蒸除去氧化物,然后 答:通过定点突变改变一个组氨酸。

用 Tris-HCl 饱和酚,并调整 pH 到中性。用缓冲液饱和酚还有第二个作用,就是防止酚吸收更多的 DNA 溶液,降低 DNA 的损失率。 4.为什么氧化变色的酚不能直接用于 DNA 的分离?应如何处置? 答:因为苯酚与空气接触氧化成粉红色的醌。苯酚氧化生成的醌能够形成游离的自由基,这种自由基能够引起磷酸二酯键的断裂,造成 DNA 降解。氧化的苯酚须经高温重蒸以除去氧化物,并且在重蒸后的酚中添加抗氧化剂,如β—巯基乙醇和 8—羟基喹啉,浓度只需 0.1%。重 蒸酚能够用锡箔纸包起来避光保存在低温下。 5.在 DNA 分离过程中,酚通常与氯仿联合使用,即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次,为什么? 答:原因是酚和水有一定程度的互溶,所以单独使用酚抽提 DNA,最终不能除去酚,残留的酚会使起切割和连接作用的限制性内切核酸酶 和连接酶变性。氯仿也是蛋白变性剂,它不与水互溶,但是能够同苯酚互溶,这样,酚和氯仿联合使用,就可以带走残留的酚。 6.说明溴化乙啶—氯化铯密度梯度离心纯化 DNA 的原理。 答:它的基本原理有以下三点: (1)氯化铯是一种高分子量的重金属,在一定的高速离心下,可以自动形成氯化铯的浓度梯度。 (2)当进行离心时,CsCl 溶液中的大分子物质将根据它本身的密度停留在不同的 CsCl 密度区,形成一个致密带,而不会像 CsCl 一样形成浓 度梯度。CsCl 溶液中大分子到底在何处形成带,将取决于大分子本身的浮力密度(buoyant density)。DNA 的浮力密度大约为 1.7g/cm , 离心时将迁移到 CsCl3 的密度为 1.7g/cm3 处。与此相反,蛋白质的浮力密度相当低,将漂浮在离心管的顶部。而 RNA 则沉淀于离心管的 底部。 (3)在有溴化乙啶存在的密度梯度离心中,能够将超螺旋的 DNA 与非超螺旋的 DNA 分离开来。溴化乙啶可嵌入到 DNA 的双螺旋分子中, 使 DNA 部分解旋,其结果可使线性 DNA 的浮力密度减少 0.125g/cm3 。由于超螺旋的 DNA 没有游离的末端,解螺旋的幅度有限,也 就只能结合有限的 EB,因此,超螺旋 DNA 的浮力密度只有少许下降,大约为 0.085g/cm3。结果,超螺旋的 DNA 将与线性、开环的 DNA 在 EB-CsCl 密度梯度离心中由于密度不同而分开。 7.采用什么措施保证 DNA 化学合成的定向性和专一性?答: (1)将不必进行反应的基团保护起来,这样可保证定向; (2)每一循环之后,清除多余的单核苷酸,并将未反应的固着核苷酸链封闭起来,保证下一个反应的专一性。 8.何谓简并引物(degenerate primer)? 答:所谓简并引物是指根据肽链的氨基酸序列(或部分序列),并充分考虑密码子的简并性而设计的、用于 PCR 扩增的混合引物群体,这种混 合引物之间具有不同的碱基组成,但碱基的数量是相同的。由于充分考虑了密码的简并性,在这种混合引物中必定有一种引物是可以和该基 因的 DNA 序列精确互补。 9.简并引物设计的一般原则是什么? 答:1)选择保守区设计简并引物;(2)选择简并性低的氨基酸密码区设计引物; (3)注意密码的偏爱性; (4)使用尽可能短的引物,以降低简并性,最短可用 15—20 个碱基。 (5)由于 TaqDNA 聚合酶在 PCR 扩增时容易掺人错误碱基,所以设计的引物,其 3’端尽量使用具有简并密码的氨基酸。 10.双脱氧法(dideoxynucleotide method)测序的基本原理是什么? 答: 双脱氧的核苷酸是人造的分子, 这种分子糖环的 2, 和 3, 碳上都没有了羟基基团, 而在天然分子中糖环的 3, 碳上有一个羟基。 在 DNA 复制中,新掺入的碱基按配对原则是天然三磷酸核苷酸,用它的 5'ct-P 同生长链的前一个核苷酸的 3,羟基连接。但是,若进入的核苷酸是 双脱氧的,则由于 3’没有羟基而影响下一个磷酸二酯键的形 成,使 DNA 的复制终止。 11.在古生物学中,尚不知道恐龙是否是温血爬行动物,而不像今天的变温爬行动物。假如你得到一些恐龙的 DNA,你如何通过 PCR 和 基因克隆来检测恐龙是否是温血爬行动物? 答:用 PCR 扩增恐龙的高度保守的酶的基因,然后将扩增的 DNA 克隆到大肠杆菌表达载体,酶可能被合成。然后测定酶的最适温度和热的 稳定性并与相应的温血动物(如鸟类)进行比较。来自于冷血动物的酶与来自于温血动物的酶相比,温血动物最适的温度范围较宽。

第七章

克隆策略与体外重组 ; ; 。 (2) (3) 、 。 (2) (4) 。 。 (3) 、 。 。

一、填空题 1.克隆策略有三层涵义:(1)第一层是 (2)第二层涵义是 (3)第三层涵义就是 2.假定克隆一个编码某种蛋白质的基因,必须考虑其表达的三个基本条件: (1) 4.受体细胞的感受态是 5.DNA 重组连接的方法大致分为四种:(1) 3.现有的基因克隆策略大体上分为三类:

6. 平末端连接法(blunt end ligation)的连接效率比黏性末端连接的效率低得多, 所以通常在连接反应体系中适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂, 以提高平末端 DNA 连接的效率。常用的凝聚剂是 7.一个细菌的表面大约有 (1) (2) (3) 个同 DNA 结合的位点。 。 ,各种此类质粒的集合体称之为构建了一个 ,源于同一批 RNA 制备物的克隆群则构建了一个 。 。

8.1984 年,Hung 和 Wesink 发现如果两个不同的 5’黏性末端通过部分填补得到如下的单链突出末端,即可有效地相互连接: 9.将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个 10.将含有一个 mRNA 的 DNA 拷贝的克隆称作一个 11.在构建 cDNA 克隆之前,可以用 12.一旦克隆了一个遗传定位的基因,就可以用 13.只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成,用 14.SD 序列是 mRNA 分子中同——结合的序列,其结构特征是 15.环状质粒的转化效率很低,通常是线性双链 DNA 转化效率的 16.cDNA 技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法,因为它可以用 因而有利于在原核细胞中进行功能表达。 17.产生平末端的方法通常有:(1) 19.人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为 20.感受态细胞是可以诱导的,诱导的方法有 (2) 时吸附 DNA, 、 、 , 杂交,最后建成的 或 处理和 。 动物,这些外源基因就叫做 (3) 。 、而枯草杆菌感受态的出现是在 时摄入 DNA。 。 , 库。 。 。 。 才有一个切点。 。 18.不同细菌出现感受态的时期是不同的,如肺炎球菌感受态出现的时期是

来富集一特殊的核苷酸序列。做法是:用来自于能够产生目的蛋白的细胞 mRNA 分子同 技术来鉴定基因组 DNA 文库中与之相邻的基因克隆。 可以将这段 DNA 进行百万倍的扩增。 的全部或一部分。 。 为模板通过反转录合成一个双链的、无 的基因,

来自于另一类型细胞(不产生这种蛋白质,但亲缘关系密切)的过量 mRNA 分子杂交。

21.影响酶切的主要因素之一是底物 DNA,底物的影响包括 22.Sal I 是识别 6 个核苷酸的酶,其识别切割的理论值是 23.在精简基因组文库中,用标记的 24.构建基因组文库时连接方法主要是 同未标记的

个碱基就有一个切点,但在哺乳动物中,大约

;而构建 cDNA 文库,可用

25.将携带有外源基因并能持久传递给子代的动物称为 26.为了提高重组 DNA 分子对 E.coli 的转化效率,通常可采取 填空题答案:

1. (1)采取什么样的技术路线将目的基因从基因组中克隆出来;(2)用什么方法将目的 DNA 同载体相连;(3)通过何种方法将体外连接的 DNA 分子导人适当的受体细胞进行扩增或表达。 2. (1)保持正确的可读框; (2)能够使其转录的启动子;(3)具有翻译的起始和终止信号 3. 功能克隆、定位克隆、表型克隆。 6. PEG8000。 7. 50。 10.cDNA 克隆;cDNA 文库。 11.差示杂交。 12.染色体步移。 4. 接受外源 DNA 的生理状态 5. (1)黏性末端连接; (2)平末端连接; (3)同聚物接尾连接; (4)接头连接法 8. (1)长度仅为一个核苷酸,而且互补;(2)长度为两个核苷酸,都互补或有一个位点错配;(3)长度为三个核苷酸,允许一个错配 9. 基因组 DNA 克隆; 基因组 DNA 文库。 13.聚合酶链式反应(PCR)。14.核糖体 RNA;AGGAGG。 15.1% 18.对数期;对数后期。 19.0℃;42℃。 22.4096;300kb。 16.mRNA; 内含子。

17.(1)平切的酶; (2)S1 核酸酶切除黏性末端; (3)DNA 聚合酶补平黏末端。 20.化学试剂法;核酸酶抑制法;饥饿法。 21.DNA 的浓度; DNA 的纯度; DNA 的二级仨级结构;识别位点和邻近的特异性序列 23.突变体 DNA;野生型 DNA; 缺失部分的 DNA。24.黏性末端连接;接尾连接法;人工接头连接法 25.转基因的;转移的基因。

26.Ca2+;42℃处理两分钟。

二、判断题 1.外源基因(或 DNA 片段)插入到某一基因内的位点后,这个基因不再有任何功能。 2.用不同的产生黏性末端的限制性内切核酸酶分别切割载体和外源 DNA,得到的黏性末端是不亲和的黏性末端。 3.基因组 DNA 文库是含有某一生物中全部 DNA 序列随机克隆的克隆群,而 cDNA 文库是含有某一生物中所有表达基因随机克隆的克隆群。 4.cDNA 克隆较之基因组克隆最重要的优越性就是它们含有一个基因的完整序列。 5.通过差示杂交后制备的 cDNA 文库使克隆那些只在特定分化细胞中表达基因的机率大为提高。 6.在染色体步移中,可通过 DNA 测序知道已到达所感兴趣的基因。 7.一旦有了一套已知顺序的基因组克隆,通过从文库中获得覆盖目的突变基因所在基因组区的所有克隆,就可以进行染色体步移。 8.根据遗传连锁作图把基因定位在基因组中是定位克隆的第一步,它为分离特定的人的基因提供了一个直接而快速的方法。 9.人工感受态和自然感受态细胞都能吸收线性和环状单链 DNA。 10.人工导入基因和正常染色体基因间的同源重组,可以发生基因置换。 11.为了保证重组 DNA 分子在受体细胞中能够稳定地独立存在下来,通常用 rec r m 表型的细胞株作为受体菌。 12.线性 DNA 片段被导人哺乳动物细胞后,在细胞内酶的作用下,很快相互连接成重复的 DNA 大片段,并能在随机位点整合到染色体中。 13.不匹配的黏性末端是不能通过黏性末端连接的。 14.用限制性内切核酸酶切割载体、供体 DNA 后,要加入 EDTA-SDS 中止液使限制性内切核酸酶失活,这样有利于重组连接。 15.限制性内切核酸酶 BglⅡ识别的序列为 A GATCT,BamHI 识别的序列为 GGATCC,用它们分别切割载体 DNA 和供体 DNA,不必使 酶失活,就可以直接通过黏性末端连接法进行连接。 16.具有 EcoRⅡ末端的外源片段只能以一个方向插入到 EcoRⅡ末端的载体中。 17.不匹配的黏性末端可以通过部分填补后进行连接。 18.低丰度的 mRNA 不仅拷贝数少,而且种类也少。 19.同聚物接尾法构建重组体,不仅连接效率高,而且也很容易回收插入的片段。 判断题答案: 1. 错误。原有的功能丧失了,但有可能具有新的功能。2. 错误。不一定,如果是同裂酶也会产生亲和的黏性末端。 3. 错误。cDNA 文库只含有那些在用于构建文库的细胞类型中表达的基因。此外,每一个表达的基因在文库中的存在水平也是不同的,这 取决于它们的表达水平。 4. 错误。cDNA 克隆含有一个基因的连续编码序列,而不是完整的基因序列。在 mRNA 的产生过程中,内含子被切除了。 5. 正确。6. 错误。染色体步移对全序列的 DNA 通常太长,仅靠测序,无法进行。所感兴趣的基因通常是用转基因实验进行鉴定或是用 其他方法进行鉴定,在人的基因鉴定方面尤其是如此。 7. 正确。8. 错误。虽然这种方法很直接了当,但按这种方法,目前需要 10—100 个人做若干年才能分离一个人的基因 9. 错误。自然感受态不能吸收环状单链的质粒 DNA。10.正确。11.正确。12.正确。 13.错误。有时可通过部分填补后得到的黏性末端进行连接。 14.错误。如果酶切片段用于连接,最好不用 EDTA-SDS 中止液使内切酶失活,因为它们也会抑制 DNA 连接酶的活性。 15.正确。16.正确。17.正确。18.错误。种类多。19.错误。同聚物接尾法构建重组体,虽然连接效率高,但不易回收插入的片段。 三、选择题(单选或多选) 1.重叠群(contig)是一群克隆,在这个克隆群体中各个体( (a)相互之间重叠 (a)YAC 文库 (b)都是来自不同生物的克隆 (b)MAC 文库 (c)扣减文库 ) (d)位于同一染色体的不同区段 )属 cDNA 文库 (c)插人片段位于不同染色体的不同区段 (d)BAC 文库 ) (d)一般是人工合成后添加到载体中 (d)注意只能填补载体 (c)不同酶的识别序列可以有重叠 ) (c)限制 dNTP 的种类
- - -

2.根据构建方法的不同,基因文库分为基因组文库、cDNA 文库等。在下列文库中,( 3.下面关于多克隆位点(multiple clone site,MCS)的描述,不正确的—句是( (a)仅位于质粒载体中 (b)具有多种酶的识别序列 4.部分填补是 DNA 体外重组中常用的一种技巧,填补时应( (a)控制 DNA 聚合酶的用量 5.在下列限制性内切核酸酶中,( (a)Hind Ⅲ (b)EcoRⅡ (b)控制酶反应的时间 (c)BamHI (d)PstⅠ )。

)的识别序列中有松弛碱基,选用这种酶时要考虑连接后外源 DNA 的插人方向。

6.EcoRI 切割载体 DNA 和供体 DNA 所产生的片段在用于重组连接前要( (a)用 65℃处理 5~10 分钟使限制性内切核酸酶失活 (c)进行琼脂糖凝胶电泳监测 (a)限制性内切核酸酶切除 (a)用 SSC 缓冲液 (d)上述说法都正确 ) (c)用 S1 核酸酶切除 (b)用 3’外切核酸酶切除 ) (c)加入 BSA 等保护剂
2+

(b)用 CIP 处理载体 DNA 防止自身环化

7.在 cDNA 技术中,所形成的发夹环可用( 8.在 DNA 的酶切反应系统中,通常:(

(d)用 5’外切核酸酶切除 (d)上述说法中,有两项是正确的

(b)加入 Mg 作辅助因子

9.黏性末端连接法,不仅操作方便,而且( (a) 产生新切点 10.在下列表型中,(

) (c)载体不易环化 ) (d)增加调控元件 (d)开口的双链环状 DNA (d)内含子和调控区 ) (d)影响外源基因的表达 (b) r m rec
- - -

(b)易于回收外源片段

)是基因工程上理想的受体菌表型 (a) r +m+ rec+

(c) r m rec+





(d)r+ m+ rec



11.关于 DNA 接头在基因工程中的作用,下列说法中哪一项不正确?( (a)给外源 DNA 添加适当的切点 (a)完整的线性双链 DNA 13.cDNA 文库包括该种生物的( (a)某些蛋白质的结构基因 12.DNA 的结构对转化的影响很大,一般说来,转化效率最高的是:( (b)单链线性 DNA ) (b)所有蛋白质的结构基因 )

(b)人工构建载体 (c)调整外源基因的可读框 (c)完整的环状双链 DNA (c)所有结构基因

14.下列关于建立 cDNA 文库的叙述中,哪一项是错误的?( (a)从特定组织或细胞中提取 DNA 或 RNA (c)以新合成的单链 DNA 为模板合成双链 DNA (a)操作方便 (b)易于回收片段 )

(b)用反转录酶合成 mRNA 的对应单链 DNA (d)新合成的双链 DNA 甲基化 ) (d)载体易于自身环化,降低重组率 (c)以 mRNA 为模板合成的双链 DNA (d)以上都正确

15.下列对黏性末端连接法的评价中,哪一项是不正确的? ( (c)易于定向重组 16.关于 cDNA 的最正确的提法是:( (a) 同 mRNA 互补的单链 DNA (a)具有可诱导性 11.d; 12.a; 四、简答题 1.cDNA 克隆与基因组克隆有何不同? 答:基因组克隆包含所有不在 cDNA 中出现的内含子。 2.怎样将一个平末端 DNA 片段插入到 EcoRI 限制位点中去? (b)具有可转移性 2.C; 14.a;

(b)同 mRNA 互补的双链 DNA )

17.关于感受态细胞性质的描述,下面哪一种说法不正确?( 选择题(单选或多选)答案:1.a; 13.a; 3.a;

(c)细菌生长的任何时期都可以出现 4.C; 5.b;6.d; 15.c; 16.c; 17.c

(d)不同细菌出现感受态的比例是不同的 7.c; 8.a,b,c; 9.b; 10.b;

答:化学合成一些长为 10bp 含有 EcoRl 识别位点的短的 DNA 片段,然后与待克隆片段两端连接起来,如果用 EcoRI 切割这种连接 片段,就会产生 EcoRI 的单链末端。这种片就可以插入到任何 EcoRI 的限制性内切酶位点中。 3.有哪些可能的原因使一个基因在 DNA 库中丢失? 答:可能的原因有:(1)假定这个基因在高拷贝数的载体上,由于它的产物太多,而对宿主是有毒的;(2)在部分消化中,某个基因中含有 所用酶的切点;(3)酶切位点离基因太远,结果由于 DNA 片段太长而不能有效地克隆 4.简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。 答:(1)COS 位点可以自身环化;(2)可以利用 COS 位点包装入噬菌体颗粒;(3)可以感染寄主细胞;(4)利用质粒复制子复制,不整合、不裂解。 5.一个双链 DNA 分子(为 5,突出端)可采用哪些方法使之加上 dAl00—120 的尾巴? 答:有三种方法:(1)λ外切核酸酶处理,得到 3’突出末端后,用 TdT 处理(Mg2+作辅助因子); (2)S1 核酸酶处理后,用 TdT 处理(Co2+ 作辅助因子); (3)用 DNA 聚合酶补平后,用 TdT 处理(Co2+作辅助因子)。 6.酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在,必须有哪些基本的结构? 答: (1)着丝粒; (2)端粒; (3)ARS 序列。 7.何谓 YAC?主要特性是什么? 答: (1)含有来自其他生物 DNA 的酵母人工染色体,叫 YAC; 答: PCR 用双引物,体内复制用单引物。 9.在构建 cDNA 文库时,为什么常用 GC 接尾而不用 AT 接尾法连接? 答: GC 接尾法,可通过载体的 PstI 的切点回收外源片段,而 AT 接尾尚无回收的好办法。 10.用限制性内切核酸酶切割 DNA 后,经电泳检查,发现有拖尾现象,其可能的原因是什么? 答:可能的原因有:蛋白与 DNA 的结合、酶混杂、酶切条件不合适、有外切核酸酶污染等。 11.欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如 E.coli)中进行表达,克隆时应注意哪些问题? 答:应注意的问题有:启动子、密码子、剪接、分泌。 12. 假定你分离到一个 E. coli 的 Thy-突变体, 并推测有可能是 ThyA 基因突变。 请设计一个方案用 PCR 从染色体 DNA 扩增突变的 ThyA 基因,测定突变的序列。(注:E.coli 野生型的 ThyA 基因的序列是已知的) 答:为了扩增突变体的 thyA 基因,先设计一对引物,其中一个引物的序列与 thyA 基因 的 5’端相同,另一个引物同该基因的 3’端互补。 在引物的 5’端加上合适Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列,以便于后来的克隆。将染色体 DNA 同引物混合后,进行 PCR 扩增。然后进行 琼脂糖凝胶电泳,纯化扩增片段,可以直接测序或克隆到合适的载体再测序。 (2)主要特性是可以克隆较大的外源片段。 8.Muller 的 PCR 反应同大肠杆菌体内的 DNA 复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里?

五、问答题 1.如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成,可以通过何种方法克隆该基因? 答:可以通过合成核苷酸探针或设计简并 PCR 引物从 cDNA 文库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体从 cDNA 表达文库中筛选 相应的克隆。 2.何谓定位克隆(positional cloning)? 答:定位克隆又称为图位基因克隆(map-based cloning),是根据遗传连锁分析定位基因,然后利用与目的基因遗传距离最近的分子标记筛 选基因组文库,分析阳性克隆与目的基因之间的物理图距,进而进行染色体步查(chromosome walking),建立包含目的基因位点的多层次重叠 群(contig),最后通过表型分析、功能互补的方法确定目的基因。 3.何谓染色体步移(chromosome walking)? 答:染色体步查是图位克隆中寻找感兴趣基因或 DNA 片段所在位置的研究方法。其基本过程是:先根据遗传学分析确定感兴趣基因所在 染色体的大致位置,然后应用与之连锁的遗传标记作为分子探针,从基因文库中筛选出与此标记 5,端和 3,端部分重叠的 DNA 克隆,再 以筛选到的 DNA 克隆去筛选与它们邻接的 DNA 克隆。这样所筛得的 DNA 克隆分 SU 向 5,和 3,方向依次排列、延伸,逐步扩大 DNA 序列的覆盖范围,最后用生物学性质和测序方法测定待寻找的基因。 4.在染色体步移中,用哪些方法获得克隆的末端? 答: (1)利用载体克隆位点的通用引物,如 T3 和 T7 启动子引物; (2)如果克隆位点两侧没有 T3 和 T7 启动子,可用克隆的酶识别的 DNA 序列与随机引物去扩增末端; (3)如果已知两个克隆的重叠部分,可直接将重叠部分切下来进行标记,然后用这个探针进行筛选。 5.何谓表型克隆(phenotype cloning)? 答:表型克隆是将表型与基因结构或表达的特征联系起来,从而分离特定表型相关的基因。不必了解基因产物的功能、基因定位,不必 假设基因数目及相互作用。基因组错配筛选技术(GMS),代表差异分析技术(RDA),RNA 差异显示技术(mRNA DD)均归于表型克隆。 6.什么是基因文库? 答: 基因文库,或克隆文库,是一群细菌克隆,每个克隆含有一个带有某一供体生物不同 DNA 片段的质粒或噬菌体载体;这群克隆有 95%一 99%的可能性使基因组 DNA 的每一片段至少存在于一个克隆中。一个基因文库一旦建立,任一特定的克隆都可被回收用于研究其所 携带的基因,因而在需要克隆某一特定基因时就避免了逐个巡查克隆的耗时过程。为减少所要收集的克隆的数目,最普遍采用的载体是丸噬 菌体的一种衍生载体,它可容纳 12—20kb 的供体 DNA 片段,这点与 pBR322 不同,它可插入的外源 DNA 最大约为 5kb。 7.什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库,涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同? 答:基因组文库是用基因工程的方法,人工构建的含有某一生物基因组 DNA 的各种片段的克隆群。一般以改造的噬菌体 DNA 或黏粒作为 载体,包括下列过程:(1)高分子量染色体 DNA 的制备;(2)体外重组连接;(3)包装蛋白的制备;(4)重组体的体外包装;(5)将重组 DNA 导 人寄主细胞;(6)筛选。 基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene p001)是指在 进行有性生殖的某一群体中,能进行生殖的个体所含 总的遗传信息。在基因组文库 的构建中,由于使用的载体不同,分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC 文库、BAC 文库等。 8.什么是 cDNA 文库(complement DNA library)?同基因组文库有何差别? 答:同 mRNA 互补的 DNA 称为 cDNA。cDNA 文库是以某一生物的总 mRNA 为模板,在无细胞系统中,在反转录酶的作用下,首先合成 一互补的 DNA,即第一链,破坏 RNA 模板后,再以第一链为模板合成第二链,得到的双链 DNA 称为 cDNA。选用适合的载体,将合成的 cDNA 重组导人寄主细胞,经筛选得到的 cDNA 克隆群称为 cDNA 文库。由于 cDNA 技术合成的是不含内含子的功能基因,因此是克隆 真核生物基因的一种通用方法。 由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的, 具有发育的阶段性和时间性, 有些则需要特殊的环境条件。 所以,cDNA 文库是不可能构建得十分全,也就是说任何一个 cDNA 文库都不可能包含某一生物全部编码基因。cDNA 文库与基因组文库的 主要差别是: (1)基因组文库克隆的是任何基因,包括未知功能的 DNA 序列,cDNA 文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因,包括调节基因; (2)基因组文库克隆的是全部遗传信息,不受时空影响;cDNA 文库克隆的是不完全的编码 DNA 序列,因它受发育和调控因子的影响; (3)基因组文库中的编码基因是真实基因,含有内含子和外显子;而 cDNA 克隆的是不含内含子的基因。 9.黏性末端连接法是最常用的连接方法,具有许多优点,但是也有一些不足,请指出这些不足之处。 答:黏性末端连接法不足之处有:(1)载体易自身环化;(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆;(3)难插 入特定的基因;(4)再者就是大片段 DNA 的重组率较低,即使用碱性磷酸酶处理了载体,防止了载体的自身环化,载体也有成环的倾向;(5) 用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体,增加筛选工作的困难。 10.什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优缺点? 答:所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链 DNA 的 3’端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工黏性末端,外源 DNA 和 载体 DNA 分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如 dA(dG)和 dT(dC),然后在 DNA 连接酶的作用下,连接成为重组的 DNA。这种方法的 核心是利用末端转移酶的功能,将核苷酸转移到双链 DNA 分子的突出或隐蔽的 3'-OH 上。以 Mg2+作为辅助因子,该酶可以在突出的 3'-OH 端逐个添加单核苷酸,如果用 C02+作辅助因子,则可在隐蔽的或平末端的 3'-OH 端逐个添加单个核苷酸。 同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法,具有很多优点:(1)首先不易自身环化,这是因为同一种 DNA 的两端的尾巴是相同的,

所以不存在自身环化。(2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端,所以连接效率较高。(3)用任何一种方法制备的 DNA 都可以用这种 方法进行连接。同聚物加尾法也有一些不便之处:(1)方法繁琐;(2)外源片段难以回收。由于添加了许多同聚物的尾巴,可能会影响外源基因 的表达。 另外要注意的是,同聚物加尾法同平末端连接法一样,重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。 11.几何谓接头连接法(1inker ligation)? 答:将人工合成的或来源于现有质粒的一小段 DNA 分子(在这一小段 DNA 分子上有某种限制性内切核酸酶的识别序列),加到载体或外 源 DNA 的分子上,这样便在载体 DNA 和外源 DNA 上制造出新的酶切点。把这一小段含有酶切点的 DNA 分子称为连接器分子,这种方法 称为接头连接法。 12.什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高? 答:同裂酶是一类识别序列不完全相同,但是产生的黏性末端至少有四个碱基相同的限制性内切核酸酶。用这些限制性内切核酸酶处理 载体和外源 DNA 得到的末端可以通过黏性末端连接法连接。 同裂酶产生的黏性末端虽然可以像完全亲和的黏性末端那样进行连接, 但是它与完全亲和的黏性末端连接不同的是, 连接后的产物往往失 去原有的限制性内切核酸酶的切点,但是能够被另外一种同裂酶识别。这样用同裂酶进行体外重组时,在限制性内切核酸酶切割反应之后不 必将原有的内切酶失活,就可直接进行重组连接。由于连接体系中有原有的限制性内切核酸酶的存在,就不会发生载体自连,从而保证了载 体同外源 DNA 的连接。所以在这种连接反应中不必用碱性磷酸酶进行载体的脱磷反应而得到最高的连接效率。 反应中通常要涉及三种不同的限制性内切核酸酶,其中两种是识别六碱基的酶,另一种是识别四碱基的酶。 13.如何使用甲基化酶对克隆 DNA 进行保护?有什么意义? 答:在构建基因文库时,可用与接头中限制性内切核酸酶相应的甲基化酶对克隆 DNA 先进行甲基化修饰,将插入片段上该酶可能的识别 序列先行保护起来。 用这种方法,不仅保护了插入片段的大小不会改变,又有利于插入片段的回收,因为插入片段中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护 起来,重组后可以用特定的限制性内切核酸酶将插人片段回收。 14.何谓稀有酶?(举例说明) 答:所谓稀有酶是指那些识别序列在基因组 DNA 中不常见的酶, 因此它们的切割频率较低。如 NotI 就是最常用的稀有酶, 它的识另 Jj 序 列为 GC↓GGCCGC。另外有些酶的识别序列虽然不长,但它的识别序列很特别,在基因组出现的频率较低。如 NruI (TC↓GCGA),它们的靶 序列在哺乳动物基因组中出现的频率极低。 15.为了大量获得许多用于生化鉴定的产物,你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达,你如何确保 最终能得到产物? 答:由于基因已被测序并进行了分析,因此前体 mRNA 结构是已知的。这对了解蛋白质的功能区是十分重要的,可以避免有关多肽翻译后 加工的一些问题。对于间断基因,cDNA 可以用外显子 DNA 探针通过体外杂交得以鉴定。将拟南芥的基因组 DNA 或 cDNA 分别克隆到 酵母人工染色体(YAC)上作为定位或筛选的融合标签,基因可以在酵母中作为细胞质蛋白质或分泌蛋白质进行表达。 16.若在进行 DNA 重叠群分析时,你发现在一个编码有价值但不稳定蛋白质的可读框之后,紧接着另一个可读框,它可在蛋白质的 C 末端 加上一个稳定结构。举出至少两种获得被修饰蛋白产物的方法。 答:首先,可引入无义 tRNA 阻遏物在原有的转录物上造成通读。另外,可以将该 DNA 片段克隆到质粒上表达融合蛋白或者通过同源重组 整合到基因组中表达。后一途径可用于真核生物,例如二倍体酵母,而且在单倍体分离后可进行功能分析。 17.某一质粒载体具有 Tet r 和 Kan r 的表型,在 Kan 抗性基因内有一 Bgl I 的切点。现用 Bgl I 切割该载体进行基因克隆,问:(1)转化后 涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体? 答: (1)加四环素; (2)Tet r Kans 和 Tet r Kan r; (3)重新点种在含 Tet、Kan 和只加 Tet 的平板上,选择只在 Tet 平板上生长的菌落,即为所需的重组体。 18.限制性内切核酸酶 BamH I 和 Pst I 切割某一 DNA 序列,结果示于图 1。

图 1

BamHI 和 Pst I 识别序列处的切割,只显示识别位点的核苷酸序列

(1)指出被切割 DNA 分子的 5’端和 3’端; (2)如果你将切割后的 DNA 同 DNA 聚合酶、4 种 dNTP 在一起温育,这些 DNA 末会有什么样的变化? (3)经过(2)中的反应后, 你还能够用 T4 DNA 连接酶将 BamH I 末端连接起来吗? Pst I 末端呢? (T4 DNA 连接酶能够连接平末端和黏性末端) (4 ) (3)中的连接后,能够重新形成 BamH I 位点吗?Pst I 位点呢? 答:(1)切割分子的 5’和 3’末端示于图 A20.1 中。上面一条链的左边是 5’端,这是表示 DNA 序列的标准方法。

(2)如图 1 所示, BamHI 的末端能够被 DNA 聚合酶填补, 而 PstI 的末端却不能。 这种差异是由 DNA 聚合酶的作用条件所决定的: dNTP 只加到具有 3'-OH 的引物上,并且要有一条保证正确添加的模板链。BamHI 的末端可以满足这些条件,但 PstI 的末端却不能,因其具有隐 蔽的 5’末端,这种末端是不能作为引物的,故不能被填补。

图 1 含 BamHI 或 PstI 位点 DNA 的切割、修饰和连接, 括 号表达限制性内切核酸酶的识别位点 说明:在重组 DNA 技术中,标准方法是用 T4DNA 聚合酶 来补平这两种类型的末端。 T4DNA 聚合酶通过填补的方式来 补平 BamHI 末端,但它却是靠 3’→ 5’外切核酸酶的活性除 去 3’突出端,留下一个平末端的方式来补平 PstI 的末端。

(3)如图 A20.1 所示,平末端化的 BamHI 末端和未被修饰的 PstI 末端二者都能被 T4DNA 连接酶连接。 (4)连接处理过的末端可以再产生 PstI 的位点,但不会产生 BamHI 位点(图 A20.1)。切割、填补末端、并重新连接,常会产生新的限制性位 点,这些位点对于进一步的操作有时是有用的。 第八章 重组克隆的筛选与鉴定 ,二是将 (3) (4) ,二是 。 探针和 探针。 进行 3’末端标记。如果用限制性内切核酸酶切割 (3) 。 。 。 。 。 等。 。

一、填空题 1.重组体的筛选有两层涵义,一是将 (1) (2) 2.目前,在重组体的筛选中,已经发展了许多构思巧妙、具有极高准确性的筛选方法。大致可以分为 3.噬菌斑形成选择法有两种判断标准,一是 4.PCR 扩增筛选重组体是比较简便的筛选方法,它适合于 5.核酸杂交探针可分为两大类:DNA 探针和 RNA 探针。其中 DNA 探针又分为 6.如果用限制性内切核酸酶切割双链 DNA 产生 5,突出的黏性末端,则可以用 DNA 产生的是 3’突出的黏性末端,可以用 7.单链 DNA 探针的标记可以采用下列方法:(1) 8.根据 Northern 杂交的结果可以说明: 9.差示杂交(differential hybridization)技术需要 11.在 12. 进行 3’末端标记。 (2)

10. RNA 分子经凝胶电泳后按大小不同分开, 然后被转移到一张硝酸纤维素膜(尼龙膜)上, 同一放射 DNA 探针杂交的技术称 使用核酸探针检测细胞和组织中特定核苷酸序列的位置。

技术中,DNA 限制性片段经凝胶电泳分离后,被转移到硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上,然后与放射性的 DNA 探针杂交。 ,然后跟踪报告蛋白在细胞中的行为即可。 的活性。 。 分子。 。 。 。 ,而且不含 。 (2) ,温度过高, (3) ,不利于标记。 。 同 的杂交。 。

13.为了鉴定某一具有特殊功能蛋白质的结构,可以用一个容易检测的报告蛋白制备 14.可用 T4DNA 聚合酶进行平末端的 DNA 标记,因为这种酶具有 15.硝酸纤维素膜(NC)结合 DNA 的能力为 17.在 Southern 印迹中,DNA 转移的速度取决于 18.根据噬菌斑的清晰程度筛选重组体主要是 cⅠ基因的 19.用不对称 PCR 合成单链 DNA 探针时,两个引物的浓度比为: 20.微细胞是一种 E.coli 的突变体,通常只有正常细胞的 21.点杂交的主要缺点是 23.阻断翻译杂交法是 ,尼龙膜(Nylon)为 和 和

16.如果对一个克隆的基因进行遗传操作,使互补的链转录,会产生同正常的 RNA 转录物互补的

22.根据外源片段提供的遗传表型筛选重组体,必需考虑三种因素: (1) 24.在切口移位标记探针时,DNaseI 处理 DNA 的温度应控制在

25.Northern 印迹和 Southern 印迹有两点根本的区别: (1) 26.放射免疫筛选的原理基于以下三点: (1) 填空题答案: 1. 携带有外源插入 DNA 片段的克隆挑选出来;携带有特定外源插入片段的重组体挑选出来 2. (1)遗传学方法; (2)物理筛选法; (3)核酸杂交法; (4)表达产物分析法 3. 能否形成噬菌斑;形成斑的清晰度。 5. 基因组 DNA;cDNA。 8. 外源基因是否进行了转录 9. 两种不同的细胞群体能够表达不同的基因,即在一个群体中能够表达一些基因,而在另一个细胞群体中不能表达这些基因 10. Northern 印迹。 11. Southern 印迹。 12. 原位杂交。 13. 融合蛋白。14.5’→3’合成酶;3’→ 5’外切核酸酶 22.(1)克隆的是完整的基因;(2)使用的是表达载体;(3)不含内含子 15.80—100μg/cm2, ;350—500μg/cm2。16.反义 RNA。17.DNA 片段的大小;琼脂糖凝胶的浓度。18.失活。19. 50:1—100:1 20.1/10 大小; 染色体 DNA。 23.DNA;mRNA。 21.有一定比例的假阳性。 24.14—16~C; 使 DNaseI 的活性增强,导致切口过多,使 DNA 的长度变短 4. 插入外源片段的种类较多,大小又极为相似的重组体的筛选 6. Klenow 酶填补的方法;T4DNA 聚合酶 (2) (2) (3) 。 。

7. (1)用 M13 噬菌体载体合成单链 DNA 探针;(2)从 mRNA 反转录合成单链 cDNA 探针;(3)用不对称 PCR 合成单链 DNA 探针

25.(1)印迹的对象不同:Northern 是 RNA,Southern 是 DNA;(2)电泳条件不同,前者是变性条件,后者是非变性条件 26.(1)抗体能够被吸附到固体支持物上;(2)同一个抗原可以同几种抗体结台;(3)抗体能够被标记 二、判断题 1.以λ噬菌体为载体的筛选方法比较简便,凡能形成噬菌斑的就一定是重组体。 2.核酸杂交探针就是带有放射性标记的 DNA 分子。 3.在 Northern 杂交中,为了防止 RNA 形成部分环状发夹结构影响迁移率,所以要用变性缓冲液进行电泳。 4.探针的离体标记实际上是酶法标记。 5.切口移位法(nick translation)只能标记线性双链 DNA 不能标记环状双链 DNA。 6.通过原位菌落杂交得到的阳性克隆即是重组体,但不能判断插入的外源基因是否进行了表达。 7.尼龙膜(nylon membrane)是核酸杂交的一种固体支持物,具有同 DNA 结合能力强、韧性强,可反复洗脱使用,并且杂交信号本底低等优 点,就是成本高。 8.如果 DNA 序列的某种变异在群体中是稀有的,称为突变;若是普遍的,则称为多态性。 9.用寡聚 DNA 进行高度严紧的杂交可用于胎儿遗传病的诊断,可检测到因单个核苷酸变化而造成的基因突变。 10.由于基因家族中成员之间是密切相关的,因此可以用其中一个成员作为探针进行高度严紧的杂交来检测其他成员。 11.通过用化学标记法取代放射性标记法,并采用一种抗体来特异性地识别这种化学修饰,使得原位杂交的分辨率大大提高。 12.在杂交之前先用凝胶电泳将粗提取物中的 RNA 或 DNA 分子进行分离,假定杂交后只有千种或少数几种大小的片段被探针杂交上了, 就能肯定这种杂交是特异性的。 13.根据某一感兴趣蛋白质的序列、抗原性以及配基结合性质制备探针,可从 DNA 文库中筛选到相应的基因。 14.如果用其他的方法对某种蛋白质已进行过鉴定,那么要确定某一克隆是否含有该蛋白编码基因就相当容易了。 15.用 DNA 探针进行杂交反应非常敏感并具有选择性,可用来测定某一特定 DNA 序列在细胞基因组中的拷贝数。 16.双重药物选择法富集哺乳动物细胞中稀有重组体的原理是:一种药物用于选择以任意方式整合外源 DNA 的细胞,第二种药物杀死带有 随机整合 DNA 的细胞。 17.就像对培养中的鼠胚性干细胞进行遗传操作获得突变鼠一样,用 DNA 转染培养中的单个植物细胞,能够创造转基因植物。 18.NC(硝酸纤维素膜)和尼龙膜都可作为电转移 DNA 支持物。 19.单克隆抗体是淋巴细胞和瘤细胞杂交后形成的单个杂交瘤细胞经无性繁殖而产生的特异性抗体。 20.用免疫化学法筛选重组体不需要外源基因的表达。 21.用 DNA 探针同 RNA 分子杂交在测定一已知基因在某一细胞中是否表达时是很有用的,但不能用于检测转录起始位点、终止位点或内 含子的位置。 22.核酸杂交的原理是根据 DNA 分子间互补。 23.突出的 3’末端或凹缺的 3’末端都可以用 Klenow 大片段酶进行末端标记。 24.用多核苷酸激酶进行 5’末端标记前,DNA 必须进行脱磷酸,否则无法标记。 25.X-gal 显色反应的基本原理是使载体上与受体互补的α肽失活。 26.Northern 印迹和 Southern 印迹的基本原理是一样的,都是用于检测结构基因的表达。 27.在液相—液相和液相—固相杂交中,它们的杂交效率相同。 判断题答案: 1. 错误。不一定,只有置换型载体可用此法进行判断,插入型载体则不然。2. 错误。DNA 或 RNA 分子。3. 正确。4. 正确。

5. 错误。切口移位标记法既能标记线性双链 DNA 又能标记环状双链 DNA。 11.正确。 19.正确。 12.正确。 13.正确。 14.正确。 15.正确。

6. 正确。

7. 错误。杂交本底信号高。

8. 正确。

9. 正确。10.错误。虽然一个基因家族中的成员是密切相关的,但它们的序列并不完全相同。为此,杂交必须在较为宽松的条件下进行。 16.正确。 17.正确。 18.错误。NC 不可以,因 NC 结合 DNA 需要高盐,而高盐在电转移时会产生高温,破坏 DNA。 20.错误。用免疫化学法筛选重组体需要外源基因的表达。 23.错误。突出的 3’末端不可以用 Klenow 酶进行末端标记。 25.正确。 21.错误。如果用合适的核酸酶处理 DNA-RNA 杂交体,分析 DNA 探针所保护的部分就可以得到有关转录起点、终点和内含子的信息。 22.错误。 核酸杂交的原理是根据单链分子间的互补。 24.错误。不脱磷酸,也可以标记,反应的机理不同。 三、选择题(单选或多选) 1.下列各项中,需要进行液相杂交的是( (a)Southem 印迹 (b)Northern 印迹 ) (c)Slot 印迹 (d)S1 作图 )是不正确的。

26.错误。Northern 印迹用于检测基因的转录;Southem 印迹只是证明是否有外源 DNA 的存在。27.错误。液相—固相的效率高。

2.下面关于用 T4 多核苷酸激酶标记 5’端制备探针的描述中( (a)既能标记 DNA,又能标记 RNA 4.用下列方法进行重组体的筛选,只有( (a)Southem 印迹杂交 6.报告基因( ) (c)只能标记突出的 5’端不能标记其他类型末端 (b)Northern 印迹杂交

(b)既能标记双链 DNA 又能标记单链 DNA (d)DNA 或 RNA 必须有 5'-OH 的存在 (c)Western 印迹 (d)原位菌落杂交 )说明外源基因进行了表达。

(a)以其易于分析的编码序列代替感兴趣基因的编码序列 (c)能用于检测启动子的活性 (a)诱导宿主的α肽的合成 9.用菌落杂交法筛选重组体时,( (a)需要外源基因的表达 (a)它不带任何 DNA 11.切口移位是指在( (a)DNA 聚合酶 I,RNA 10.微细胞是一种大肠杆菌突变体,( )作用下,使( 8.在利用 lacZ 失活的显色反应筛选法中,IPTG 的作用是( )

(b)以其易于分析的启动子区代替感兴趣基因的启动子区 ) (d)作为显色反应的指示剂 (d)上述说法都正确 (d)它带有质粒 DNA,可以表达

(d)能用于确定启动子何时何处有活性 (b)诱导宿主的ω肽的合成 (c)作为酶的作用底物 (b)不需要外源基因的表达 ) (c)它带有染色体 DNA,但不能表达 (c)DNA 聚合酶Ⅲ,RNA (a)DNA (b)RNA (c)抗体 )带上放射性标记。 (d)DNA 聚合酶Ⅲ,DNA (d)抗原 (d)用 DNA 探针检测蛋白质片断 )

(c)要根据克隆基因同探针的同源性

(b)它的体积为正常细胞的 1/10 (b)DNA 聚合酶 I,DNA

12.用于核酸分子杂交的探针可以是放射性标记的( (a)用 RNA 探针检测 DNA 片段 (a)根据外源基因的表达

13.Southern 印迹是用 DNA 探针检测 DNA 片段,而 Northern 印迹则是:( (b)用 RNA 探针检测 RNA 片段 ) (c)根据 mRNA 同 DNA 的杂交 ) (d)根据 DNA 同 DNA 的杂交 (a)双链 DNA、单链 DNA、RNA 都是可以标记的 (b)不需要用 DNaseI 预处 (b)DNA 聚合酶 I (c)DNA 聚合酶Ⅱ (d)DNA 聚合酶Ⅲ (d)T7DNA 聚合酶 (c)用 DNA 探针检测 RNA 片段 14.用免疫化学法筛选重组体的原理是(

(b)根据载体基因的表达

15.随机引物标记探针,下列各项中哪一项是不正确的?( 理 (c)反应时可用 Klenow 酶 (d)反应时可用 DNA 聚合酶Ⅰ 16.在切口移位标记 DNA 探针时只能使用( )

(a)Klenow 酶 )

17.要对一双链的 DNA 分子进行 3’末端标记,可用( 18.关于噬菌斑筛选法的原理,下面哪一种说法不正确?( (a)噬菌斑颜色变化 选择题(单选或多选)答案: 1.d; 2.b; 3 .C ; 4.c; 19.下列筛选重组体的方法中,不属于遗传学的方法是:(

) (a)Klenow 酶

(b)DNA 聚合酶 I

(c)T4DNA 聚合酶

(b)cⅠ基因失活造成的噬菌斑的变化

(c)对 IPTG 的分解能力 (b)显色反应选择法 9.b,c; 19.d

(d)对 X-gal 的分解与否 (c)噬菌斑选择法 (d)R 环分析法

) (a)插入失活法 8.a;

5.b;6.a,c,d; 7.d; 15.d; 16.b;

10.b;11.b;

12.a,b; 四、简答题

13.C;

14.a;

17.c;

18.c;

1.点印迹与 Southern 印迹相比,有何优点和缺点? 答:两种技术都可用于分析混合 DNA 样品中是否存在能与特定探针杂交的序列。点杂交比 Southern 杂交要快,并可同时分析更多个样品。 Southern 杂交的优点在于这种技术能够显示出与探针杂交的 DNA 片段的大小。例如,Southern 杂交能测出基因重排而点杂交不能。 2.你在做 Southern 印迹分析,并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案,下面一步骤是用 NaOH 溶液浸泡凝胶,使 DNA 变性为单链。为 了节省时间,你略过了这一步,直接将 DNA 从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交,最后发现放射自显影片是空白。错在哪里? 答:如果你的杂交探针是双链的,可能因为在加入杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。 3.切口移位(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些?

答: (1)DNaseI 造成切口; (3)DNA 聚合酶Ⅲ的 5’

(2)DNA 聚合酶Ⅲ的 5’ 3’合成酶进行修补;

3’外切核酸酶进行切割;

(4)在修补过程中,随着切口(nick)的移动,将放射性的底物掺人到双链 DNA 中。

4.插入失活和插入表达法筛选重组体的主要差别是什么? 答:主要差别是: 插入失活法是直接根据失活基因的表型变化来筛选重组体; 插入表达是根据一个基因的失活引起另一个基因的表达表型来选择。 5.一个携带有氨苄和卡那霉素抗性基因的质粒被仅在卡那霉素基因中有识别位点的 EcoRI 消化。消化物与酵母 DNA 连接后转化对两种抗 生素都敏感的 E.coli 菌株。 (1)利用哪一种抗生素抗性选择接受了质粒的细胞? (2)怎样区分接受了插入酵母 DNA 的质粒的克隆? 答: (1)选择 Amp r 的转化子;(2)所需的克隆是 Ampr 和 Kanr。任何能够抗这两种药物的克隆都是自连的非重组质粒。 6.用 EcoRI 和 HindⅢ分别切割同一来源的染色体 DNA,并进行克隆,在前者的克隆中筛选到 A 基因,但在后者的克隆中未筛选到 A 基 因,请说明原因。 答:原因是:HindⅢ的切点在 A 基因内。 7.什么是 Western 印迹?它与 Southern 印迹有什么不同? 答: Western 印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上,然后用特异性的抗体进行检测。它与 Southern 的不同在于探 针的性质不同,在 Western 印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。 8.用一限制性内切核酸酶切割 Lac+ Tet r 的质粒载体,已知该酶识别的是 4 个碱基序列,并产生有两个碱基突出的单链末端,该酶在 lac 基 因内有切割位点,并在第二个氨基酸密码子内,该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后,用 DNA 聚合酶将单链末 端补齐为双链的平末端,然后重新连接成环,转化 Lac-Tet s 受体菌,筛选 Tet 转化子,问:Lac r 的基因型是什么?并说明原因。 答:基因型是 lac- 原因是在该密码子中插入了两个碱基,造成了移码突变,所以 Lac 的基因是缺陷的。 9.严紧杂交实验是如何控制的? 答:杂交反应的严紧程度由下面两个因素所决定:温度和盐浓度。强的碱基对才能耐受高的温度,而高的盐浓度使弱的碱基对间的配对 变得稳定。因此,高度严紧的杂交在高温和低盐浓度下进行,而低严紧型杂交在低温和高盐浓度下进行。 10.RNA 与基因组 DNA 复性已被广泛用于检测不同类 DNA 的转录。DNA 驱动的复性实验与 RNA 驱动的复性实验有何不同? 答: 在过量 DNA 杂交(DNA 驱动杂交)实验中, 基因组 DNA 的复性过程中加入少量的放射性标记 RNA。 因为 DNA 的量大大超过 RNA, 所以全部 RNA 能够与 DNA 杂交。同样道理,RNA 驱动的杂交反应中 RNA 过量而 DNA 的量受到限制,所以所有的互补 DNA 链都能与 RNA 杂交。 11.在基因工程中,为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物,为什么通常要用 cDNA 而不用基因组 DNA?为什么要在 cDNA 前加上细 菌的启动子? 答:这是因为细菌没有内含子剪接系统,并且不能识别真核生物的启动子之故。 五、问答题 2. 以 pBR322 DNA 作为载体,从四环素抗性基因区克隆外源 DNA 时, 可采用环丝氨酸富集法筛选重组体,说明其基本原理和基本操作过程。 答:原理: 由于四环素的作用只是抑制细菌蛋白质的合成,而不是杀死细菌;而氨基酸类似物环丝氨酸如果掺人蛋白质,则是致命的。因此 在有四环素的条件下,环丝氨酸能够杀死 tet r 而不杀死 tet s 的细菌。经过环丝氨酸处理后,存活的细胞中 tet s 型得到很大富集,而经过若 干次连续处理,即能获得在 tet r 基因内含有插人物的质粒的细胞。 基本操作: (1)转化后有三种表型的细菌,其中只有一种是重组体:Ap r Tc s ; (2)用重组 DNA 转化受体菌后,将受体菌培养在加有四环素和环丝氨酸的培养液中培养;此时只有非重组的双抗性菌可生长,其他都被抑制; (3)由于有环丝氨酸的存在,Ap r Tc s 表型的菌生长到一定程度就会死亡; (4)由于四环素只有抑菌而无杀菌作用,此时若解除四环素(离心洗涤),加入氨基苄青霉素继续培养,则可使重组体大量生长。 3.放射性抗体检测法(radioactiveantibodytest)的基本原理是什么? 答:这一方法的基本原理是根据抗体、抗原分子的三个基本特性而设计的一种筛选鉴定重组体的方法。这三个基本特性是: (1)抗体分子可以牢固地吸附在固体基质(如聚乙烯塑料)上而不被洗脱掉; (2)一个抗原可以同几种不同的抗体结合; (3)抗体分子可以通过碘化作用被 I125 标记。 4.何谓液相杂交?举例说明在分子生物学中的应用。 答:所谓液相杂交是指底物和探针都在液体中,它们的杂交靠分子间的碰撞,这是最早使用的分子杂交的方法,由于杂交效率较低,在 基因工程中已不常用。但是对于特殊的反应,例如 S1 核酸酶作图,杂交的任何一方都是不能被固定的,所以还是用此种方法 5.什么是活体标记法(汛 vivolabeling)? 答:将细胞放在含有放射性核酸底物的培养基中进行培养,然后从这种细胞中分离 DNA 或 RNA,由于细胞在生长过程中,掺人了放射性 的底物,因而被带上了标记。因这一方法是在细胞生长繁殖过程中进行 DNA 或 RNA 的标记,故叫活体标记法 6.单链 RNA 作为探针,具有哪些单链 DNA 探针所没有的优点?

答:单链 RNA 探针的下列优点是单链 DNA 探针所没有的: (1)RNA/RNA 和 RNA/DNA 比 DNA/DNA 杂交体具有更高的稳定性, 因此, 杂交可以在更严格的条件下进行, 杂交后的信号也比较强; (2)单链 RNA 由于不存在互补双链的竞争性结合,所以杂交效率比较高; (3)RNA 中不存在重复序列,所以特异性比较高; (4)杂交后可用 RNase 消化掉未杂交的 RNA,因此降低了本底。 7.什么是随机引物(randomprimer)?如何标记 DNA? 答:随机引物是人工合成的长度为 6 个核苷酸的寡聚核苷酸片段群体,含有各种可能的排列/顷序(46 =4096);或是用 DNA 酶处理小牛胸腺 DNA 后获得的 6~12 个碱基的片段。将待标记的 DNA 片段同随机引物一起进行杂交,并以杂交体上的寡聚核苷酸为引物,在 Klenow 酶 的作用下合成互补 DNA 链,当反应底物中有放射性的 dNTP 时,新合成的 DNA 就带上了标记。 8.良好的固相支持物必须具备哪些优良特性? 答: (1)同核酸分子具有较强的结合能力,一般要求每平方厘米结合核酸分子的量在 10μg 以上; (2)与核酸分子结合后,不影响其同探针分子杂交的反应; (3)与核酸分子的结合牢固,能经受得住杂交、洗涤等过程而极少脱落; (4)非特异性吸附少,在洗膜条件下,能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱; (5)具有良好的机械性能,不宜破碎。 9.以硝酸纤维素滤膜(nitrocellulosefiltermembrane)作为杂交的固相支持物具有哪些优缺点? 答:优点: (1)硝酸纤维素滤膜具有较强的吸附单链 DNA 和 RNA 的能力,特别在高盐溶液中,结合能力达到 80—100μg/cm2 。 (2)杂交信号本底较低。由于硝酸纤维素滤膜非特异性吸附蛋白质的能力较弱,因此特别适合于那些涉及蛋白质作用(如抗体和酶等)的非放射 性标记探针的杂交体系。 不足: (1)它同 DNA 的结合仅是靠疏水性的相互作用,所以并不十分牢固,在洗膜时,特别是在高温条件下洗膜,DNA 会慢慢脱落,因而 影响杂交效率。(2)硝酸纤维素滤膜容易碎裂,操作不方便。 (3)硝酸纤维素滤膜在低盐浓度下同 DNA 结合的能力不强,因此不适宜电转移 印迹法。 (4)硝酸纤维素滤膜对于小分子量的 DNA 片段(特别是小于 200bp 的 DNA 片段)结合能力不强。 10.什么是印迹(blotting)杂交? 答:通过一定的物理学方法将 DNA 或 RNA 从凝胶上转移到固体支持物,然后同液体中的探针进行杂交。DNA 或 RNA 从凝胶向滤膜转移 的过程称为印迹,故此将这种杂交称为印迹杂交。 11.什么是斑点杂交(dOthybridization)与狭缝杂交(slothybridization)? 答:将 DNA 或 RNA 样品直接点在固体支持物上,然后与核酸探针进行分子杂交,这种方法称为斑点杂交。如果借用一种模具,将核酸样 品加到模具的狭缝中,通过真空抽滤,印迹到滤膜上、然后进行杂交称为狭缝印迹杂交。 12.什么是原位菌落杂 交(colonyhybridization)? 答: 根据微孔滤膜杂交和原位杂交的原理而改良的一种筛选重组体的一种核酸杂交方法。 它是将生长在或影印在微孔滤膜上的菌落(或噬菌斑) 原位溶菌,原位进行 DNA 变性并原位固定在滤膜上,然后用放射性标记的探针同固定了的 DNA 进行杂交经放射自显影后,确定哪一个菌 落含有重组的 DNA 分子,再从参比平板上选取重组体。 13.说明 Southern 杂交的原理和方法。 答: 1975 年 Southern 建立起来的一种杂交方法,属固相—液相杂交。该法的主要特点是利用毛细现象将 DNA 转移到固体支持物上,称为 Southern 转移或 Southern 印迹(Southem blotting)。它首先用合适的限制性内切核酸酶将 DNA 切割,进行电泳分离后,利用干燥的吸水纸 产生毛细作用,使液体经过凝胶,从而使 DNA 片段由液流携带从凝胶转移并结合在固体支持物表面。 14.Northern 印迹与 Southern 印迹有什么不同? 答: Northern 印迹的原理同 Southern 印迹相比有两点不同: (1)转移的对象不同,Northern 印迹是将 RNA 变性及电泳分离后,将其转移到固相支持物上的过程。 (2)虽然 RNA 电泳前不需像 DNA 那样进行酶切,但也需要变性。不过变性方法是不同的,它不能用碱变性,因为碱变性会导致 RNA 的降解。 15.建立了一个基因文库后,如何鉴定一个携带目的基因的克隆? 答: 带有某一细菌基因的克隆通常可以直接看出来, 因为基因表达引起了宿 主细胞表型的可见变化。然而,真核生物的基因不都表达,则需用相应的 方法来找出带有所需基因特定克隆。一个常用方法是杂交(图 1): (1)从不同的克隆提取 DNA,固定于硝酸纤维素滤膜上,然后用 NaOH 使 之变性(图 1-1)。 (2)探针必须能与所需的基因互补且被 p 32 标记。探针可以是来自另一不同 生物体的相关的基因,或是依据与基因特异相关蛋白质的氨基酸序列设计 并经化学合成的一小段 DNA 分子(图 1-2)。 (3)探针只会与特定基因进行碱基配对(杂交),冲洗滤膜后,未结合上的标记 探针会被除去(图 1-3)。 (4)烘干滤膜后进行放射自显影后,所需的克隆就以一个黑点在胶片上显示出来,这就是菌落或原位杂交分析。

第九章

基因工程综合分析题

1.种子在储藏过程中发生了某种变化,使得长成的水稻很容易被一种病原菌感染。据推测可能是某一化学诱导的突变导致一个具有抗菌功能 的关键酶丢失。请设计一个实验验证这种推测是否正确,如何使种子重新获得对这种病的抗性? 提示:根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有通过其 T1 质粒将细菌 DNA 带人植物基因组的独特功能。 答:将敏感植株与抗性植株杂交后观察其后代的分离模式,判断功能的缺失与显性是否有关。通过 mRNA 差异显示分析可以鉴定敏感植株 与抗性植株基因组之间的表达差异。将获得的差示 cDNA 插入根癌农杆菌的 T1 质粒,通过转化导人敏感植株中。这样即可通过反式互补 获得目的基因克隆。该基因可以作为分子探针,通过杂交分离出野生型和突变型的基因座,由此鉴定突变体的特性,最终可以通过“基因治 疗”的方式恢复抗性。 2.一个人类疾病基因被定位在 7 号染色体一段 140kb 的区域内,并已分离到此染色体区段的克隆,但是并不知道该基因定位在此区域的哪 一位置。可用什么方法找到该基因? 答:将 140kb 的克隆片段分成一系列更小的片段,以每一个片段作为探针对其他哺乳动物的 DNA 进行印迹实验,种间保守的片段将出现信 号;这些片段可能编码外显子。用外显子片段作为 Southern 印迹实验的探针来检测带病病人 DNA,通常,遗传性疾病都是因为重要基因内 的 DNA 发生了变化所致。如果病人的 DNA 与对照 DNA 的某一片段有着不同的杂交类型,那么这一片段很可能与疾病有关。从病人和正 常对照组中分离 RNA, 用这一片段作为探针进行 Nortern 杂交。 如果病人和对照组的 RNA 的总量不同, 则这一片段很可能包含致病的基因。 3.如何以大肠杆菌质粒 DNA 为载体克隆一个编码动物激素的基因,并使之在大肠杆菌中进行表达?简要说明实验中可能遇到的问题及可能 的解决办法。 答:要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达,通常遇到的问题有: (1)细菌的 RNA 聚合酶不能识别真核生物的启动子。 (2)大多数真核基因有内含子,这些内含子在转录后从前体 mRNA 中被切除而形成熟 mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。 (3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分子加工而来的,例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的 33 个氨基酸残基而来,剩下的两段肽 链分别形成胰岛素的α、β链。 (4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。针对上述可能出现的问题,建议在克隆的过程中采取以下措施: ①应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子 ATG 的细菌强启动子的附近(含有这种序列的载体称表达载体)。 ②可以以激素 的 mRNA 为模板用反转录酶合成激素的基因。这种 DNA 不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外,如果蛋白质序列短则可通过化学合成 得到该基因。合成的基因应含起始密码 ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列,以及 1~2 个终止密码: ATG———————编码序列——————TGA TAG 现在,这个合成基因可被插入载体中。 ③有时加工过程可以在离体条件下进行。如果加工有困难,可以用合成基因,从而免除加工过程。④选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶 水解。如果用酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决,尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。 说明:1)ATG,TAG 和 TGA 是对应 mRNA 中的转录起始信号 AUG 和终止信号 UAG,UGA 的 DNA 序列。 2)克隆生长素释放抑制因子基因时采用化学合成基因的方法。生长素释放抑制因子是一种由下丘脑分泌的激素,长 14 个氨基酸残基, 因此人工合成的基因,包括在宿主菌中表达所需的转录的起始和终止信号,仅 51bp 长。 4.用 BamHI 切割一重组质粒 DNA 分子并从中分离纯化了两个 DNA 片段,一段长 400bp,另一段长 900bp。现在希望将这两个片段重新连 接起来,得到如图 1 所示的结果。 于是将这两种片段混合起来,并在连接酶的存在下进行温育,分别在 30 分钟和 8 小时取样进行凝胶电泳分析,令人惊讶的是,连接产物 并非是理想中的 1.3kb 的重组分子,而是一种复杂的片段模式(图 2A)。同时发现随着温育时间的延长,较小片段的浓度逐渐降低,大片 段的浓度逐渐增加。如果用 BamHI 来切割连接后的混合物,则起始的片段可以重新产生(图 2A)。 从凝胶中分离纯化出 1. 3kb 的片段, 并取出一部分用 BamHI 进行切割, 以检查它的结构。 正如预料的一样, 出现了两个原始的带(图 2B)。 但是用 EcoRI 切割另一部分样品, 希望能够产生两个 300bp 和一个长度为 700bp 的核苷酸片段, 然而, 凝胶电泳的结果, 令人惊奇(图 2B)。 (1)在原始连接混合物中为什么有如此多的带? (2 ) 为什么用 EcoRI 切割纯化的 1.3kb 连接物会产生那么多的片段?

图 1

杂合基因的结构 图 2 纯化 DNA 片断连接后电泳检测

答: (1)由于任意两个 BamHI 位点都可以连接在一起,产生的连接产物就很复杂。因此, 0.4kb 的片段连接在一起可以产生诸如 0.8kb、 1.2kb、1.6kb、2.0kb 等等一系列的片段。同样,0.9kb 的片段也可以产生 1.8kb、2.7kb、3.6kb 等系列片段。将这两套片段放在

一起,可以产生 1.3kb、1.7kb、2,lkb 和 2.2kb 等片段。(实际情况更复杂,因为片段自身可以首尾连接成环)。

2)由于任意两个 BamHI 末端可以连接,甚至同一大小的片段也有几种不同的结构(如图 A22.1 中的 1.3kb 片段);所以用 EcoRI 来切割 1. 3kb 片段的群体,可以产生各种不同大小的片段,范围可从 0.1kb(图 A22.1 中结构 3 和 4 的左端)到 1.0kb(图 A22.1 的结构 4 中的内部片段)。 5.四膜虫是一种双核有纤毛的原生动物。小核(微核)含有细胞染色体的主要拷贝,它参与细胞的性接合,而并不在通常的基因表达中起作用。 大核(巨核)含有细胞基因组的“工作”拷贝,由大量基因大小的双链 DNA 片段(微染色体)组成,它们活跃地进行着转录。含有核糖体 RNA 基因的微染色体拷贝数很多,可以用梯度离心进行分离。在电子显微镜下检查,每一个核糖体微染色体是一种长为 21kb 的线性结构。进行 凝胶电泳时,核糖体微染色体的迁移也是 21kb(图 3 的第一泳道)。但是,如果用限制性内切核酸酶 BglⅡ切割微染色体,产生的两个片段 (13.4kb 和 3.8kb)的总和不等于 21kb(图 3 的第二泳道),改用其他的限制性内切核酸酶切割,所产生的限制性片段的总和也都小于 21kb, 并且不同种酶切割产生的片段总和都不一样。 如果把未经切割的微染色体先进行变性和复性处理, 然后再进行凝胶电泳, 所得到的双链 DNA 片段只有 10.5kb(图 3 第三泳道);与此相似的是,将 BglⅡ切割的微染色体进行变性和复性,电泳后,13.4kb 的片段被 6.7kb 的片段 所取代 (图 3 第四泳道)。 请解释为什么限制性片段的总长度不等于 21kb?为什么变性和复性之后电泳的结果有所改变?对于核糖体微染色体 中的总序列组成你有什么看法?

图 3

四膜虫核糖体微染色体限制性分析,

数字指的是带的长度(kb)

答: 限制性内切核酸酶片段的长度不会达到 21kb,且电泳的方式也会随变性和复性而变化,这是因为核糖体微染色体是一种反向的二聚体 或是一种回文结构(图 A22.2)。也就是说,微染色体的左半部分的序列是同右半部分的序列在方向上是反向重复的。因此,一种限制性内 切核酸酶是在与末端相同距离的位点切割每一条臂(即每一重复片段),结果产生一个中央片段和两个相同的两侧末端片段。用 BgJn 切割, 中央片段是 13.4kb,两侧末端片段各为 3.8kb。凝胶上的各片段之和不到 21kb,应该将末端计算两次,即 2×3.8kb+13.4kb=21kb 微染色体或其切割后的产物经变性和复性,会改变电泳的结果,这是因为来自中央片段的单链的左右两半是互补的,可以自身复性。由于两 个互补的片段是相同的分子,其自身复性比与其他分子间的复性速度要快很多。自身复性将产生的片段的可见长度减少 1/2,因此,将未切 割的微染色体进行变性和复性,其大小从 21kb 减少到 10.5kb。同样, 13.4kb 的中央 BglⅡ片段被减少到 6.7kb。当然,末端单链片段不 自身互补,只能与其他的互补片段重新形成它们通常的双链结构。出乎意料的是,四膜虫核糖体基因存在于一个小核的染色体中,大小只有 构成大核微型染色体反向重复序列的一半。因为接合后小核产生新大核,所以核糖体基因必须从染色体中切割出来,切出的方式必须是能够 特异性地形成反向二聚体。在查阅从事此项研究工作的科学家们是如何推测之前,请你思考应如何完成该项研究。

6. X 染色体的失活是一种独特的发育调控机制, 它关闭了整个染色体上的所有基因的表达。 在人类 X 染色体中, 失活作用涉及到 1.5×108 以 上的碱基对和几千个基因。在女性中,两条 X 染色体中的任何一条失活所造成的 X 连锁基因的表达与正常男性单个 X 染色体上基因表达的 结果是相同的。 虽然失活的机理仍不了解, 一般认为失活作用是在染色体的特定区域即 X 失活中心开始的, 然后扩散到染色体的其他部分。 虽然失活染色体上的大多数基因被关闭了,但少数仍有活性,因此,可以推测 X 的失活作用与 X 连锁基因的表达模式有关。为了验证这 种推测,分离了大量的人的 X 染色体基因的 cDNA 并用 Northern 印迹法检查它们的表达。比较了这些基因在 X 染色体正常的男性和女 性细胞中的表达、在 X 染色体异常的男性和女性个体中的表达、以及在啮齿动物:人细胞杂交株中的表达,这种杂交株保留了一个失活的 人的 X 染色体(Xi)或是一个有活性的人 X 染色体(Xa)。在四种 cDNA 中,发现了三种表达模式,A、B、C 三种 cDNA 示于图 4。

图 4 来自于不同细胞中不同数目、不同类型 X 染色体的 Northern 印迹分析 RNA 先进行凝胶分离,吸印到硝酸纤维素膜上,同 A、B、 C 三种 cDNA 混合探针进行杂交,最后进行放射自显影。对应于基 因 A、B、C 的 RNA 带的位置是通过不同实验测定的

(1)指出每一种表达模式中表达的基因是来自于活性染色体、非活性染色体,还是二者都有。哪一种是最普遍的,哪一种是最特殊的? (2)根据不正常个体细胞的结果,归纳出一条规律以说明在 X 染色体失活过程中,有多少染色体被失活,多少保留活性。 答:(1)根据基因 A 在雄性和雌性中的等量表达以及在杂种细胞中的表达情况看,基因 A 只在活性的 X 染色体上表达。根据基因 B 在杂种 细胞系中的表达结果, 以及在与 X 染色体总数相关的其他细胞的表达水平, 基因 B 在活性或非活性的 X 染色体上都能表达。 根据基因 C 只 在雌性而不在雄性细胞中表达, 以及在杂种细胞系中的表达情况看, 基因 C 只在无活性的 X 染色体上表达。 基因 A 的表达方式是最普通的, 失活染色体上的绝大多数基因都被关闭了;只有像基因刀这样的少数基因才能在有活性和无活性的 X 染色体上进行表达。基因 C 的表达模 式令人诧异。现在知道只有一个基因(叫做 XIST 即 X 特异性转录)是这种表达模式。值得注意的是,该基因位于失活染色体中心的附近,并 在染色体失活过程中起直接的作用。 (2)X 染色体失活的规律是:只有一个 X 染色体保留活性,其余的全部失活。在图 22.4 所示的 Northern 印迹分析中可以看到这种规律。 无论染色体的数目有多少,在活性 X 染色体上表达的基因 A 总是以恒定的水平进行表达,这就表明只有一个 X 染色体保留了活性。相反, 只在失活染色体上表达的基因 C 只是在那些含有一个以上 X 染色体的细胞中表达,并且 X 染色体的数目决定其表达水平。 失活染色体表达的这些规律是在分子生物学技术出现前很久,从细胞生物学的观察中总结出来的。由于失活 X 染色体是高度浓缩的, 在 核中, 作为明显可分的实体即 Barr 小体很容易被观察到。 很早就注意到, 雌性细胞有一个 Barr 小体, 雄性细胞没有 Barr 小体。 含有过多 X 染色体的异常个体有很多 Barr 小体,其数目等于 X 染色体数目减一。 7.许多引起人遗传病的突变都是由单个核苷酸的取代而造成的。寡聚核苷酸的连接作用可提供一个快速检测单个核苷酸差异的手段。这种分 析方法要使用成对的寡聚核苷酸:其中一个被生物素标记,另一个具有放射性标记或荧光标记,图 5B 的一对寡聚核苷酸是为了检测镰形 细胞白血病(图 5A)而设计的。在分析过程中,分别将不同个体的 DNA 在有 DNA 连接酶的存在下,两两配对进行寡聚核苷酸杂交。 将 生物素酰化的寡聚核苷酸结合到固相支持物的抗生物素链霉蛋白上,然后通过放射自显影检查杂交结果,如图 5C 所示。 (1)你认为βA 与βS 寡聚核苷酸会同时与βAβSDNA 杂交吗? (2)这种分析是怎样区别βAβSDNA 的?

答: (1)两个寡聚核苷酸都会同βA 和βS DNA 杂交。例如,oligoβA 同βA DNA 完全匹配(20 配 20),同βS DNA 有 19 个相配。oligoβS 的情 况也是如此。除非是严格地选择杂交条件,匹配 20 同匹配 19 间的杂交是难以测到的,尤其是错配部分是在寡聚核苷酸的末端。在正常的 杂交条件下,这两种寡聚核苷酸同βA 和βS 杂交得相当好。 (2)尽管杂交本身不受错配的影响, 但由连接酶催化的连接反应却非常 敏感。如图 A22.3 所示,对于βS 寡聚核苷酸而言,只有缺口(nick)的碱 基按互补配对的原则同靶 DNA 完全配对时,才能进行连接。如果放射性 的 oligo 将被连接到生物素标记的寡聚核苷酸上, 并要固定在固体支持物 上进行 X 射线胶片曝光的话,连接是必要的条件。

8.RFLP 能够用于跟踪特定染色体区域的遗传。在一定的条件下,可用靠近缺陷基因的 RFLP 来测定未出生胎儿是否有基因缺失。一对夫妇 来进行遗传咨询, 他们的第二个孩子出生后不久死于一种遗传性疾病, 母亲又一次怀孕了。 已夭折的孩子是家系中受此遗传病影响的第二例, 另一例是孩子奶奶(父亲的妈妈)的一个兄弟。这对夫妇想知道这次所怀的孩子是否也有这种遗传病。你已经研究过这种病的遗传性,并且知 道是由常染色体的隐性基因所引起。在这种致病基因所处的染色体区内,发现整个人群中有几个限制性位点的多态性,如图 6A 所示,多态 性位点用符号+/-表示。你分离了双亲、祖父母、以及正常孩子的 DNA 样品,并用限制性图谱来分析它们的特性,结果示于图 6B。现在 开始检测胎儿,请预测什么样的限制性酶切结果表明很可能具有遗传病?

答:

只有 1,2 和 9kb 电泳带的限制性模式表明胎儿很可能具有这种遗传病。由于每个个体都是二倍体,每个基因都有两个拷贝,这就

是制作这种限制性图的主要困难。最简便的做法是,初始选用证明是同型合子的个体的单个染色体作为模式。同型合子可用两种方法进行鉴 定:它们由具有相同密度的带构成的模式,总长度 12kb。按照这些标准,母亲的祖母和父亲的祖父是同型合子。他们必定是各出一条染色体 给他们的子代。因此,母亲肯定有一个染色体与外祖母的染色体模式相同,父亲必定有一条染色体同祖父的染色体的模式相同。对一个染色 体模式的了解,使得对另一个染色体切割模式的推测变得简单。在你已分析过的家系中,有 3 种不同的切割模式:模式 I 在位点 A、B 和 C 都是“+”,产生了 1,2,4 和 9kb 的 4 条带。模式Ⅱ在位点 A 和 C 是“+”,在位点 B 是“—”,产生了 1,5 和 6kb 3 条带。模式Ⅲ在位点 A、 B 是“十”, 但在 C 是“—”,产生了 1,2 和 9 kb 3 条带。因为模式 I 在外祖母辈中是同型合子,模式Ⅱ在祖父辈中是同型合子他们都不 可能与遗传病有关。父亲是模式 I 和Ⅲ的杂合型,而母亲是模式Ⅱ和Ⅲ的杂合型。未受影响的小孩是 I 型和Ⅱ型的杂合型。在这个家族生存 下来的成员中仅仅没有纯合的Ⅲ型。另外,Ⅲ型也出现在祖母的 DNA 中,该祖母的兄弟受此病的影响。综上所述,这些观察表明:Ⅲ型(1, 2 和 9 kb 的带)很可能与这种遗传病有关。 9.你打算将一个具有 KpnI 末端的 DNA 片段克隆到具有 BamHI 末端的载体中。问题是 BamHI 和 KpnI 的末端是不匹配的,BamHI 是 5’ 突出端,KpnI 则是突出的 3’端(图 7)。一位朋友建议用图 7 所示的寡聚核苷酸“片段”来进行连接。你并没有马上意识到这种方法可行,因 为你想到的连接作用需要邻近的 5’磷酸和 3’羟基。虽然寡聚核苷酸分子被限制性内切核酸酶切割后会产生合适的末端,但是,合成的寡聚 核苷酸的末端都是羟基。另外,虽然图 7 中接头是 BamHI-KpnI,但另一个接头却是 KpnI—BamHI,你怀疑相同的寡聚核苷酸是否能够适 合这两种方式的连接。

图 7

用一咱寡聚核苷酸片段连接不互补的限制性末端的图解

(1)画出 KpnI—BamHⅡ结合体和所需要的寡聚核苷酸片段的图,这种寡聚核苷酸与图 22.7 所示的是否相同? (2)画出用连接酶处理过的分子图,指明被连接的缺口。 (3)你朋友的图解方法有效吗? 答 (1)卸 KpnI—BamHI 的接头及它的寡聚核苷酸片段示于图 4-A。这种接头片段可以用于两种连接,即 BamHI 末端和 KpnI 末端连接。

(2)用 DNA 连接酶处理混合物得到图 4-B 所示的重组 DNA 分子。如图中箭头所指,BamHI—KpnI 接头中三个缺口有两个可被连接起来。 这就足以将 KpnI 切割的片段连接到 BamHI 切割的载体中去。 (3)你朋友的方案无论是在理论上还是在实验上都很好。当 DNA 被转化到细胞之后,剩下的一个缺口能够被修复。应该注意到,可以用多核 苷酸激酶和 ATP 将寡聚核苷酸的 5’端加上一个磷酸,经这种处理寡聚核苷酸上的所有缺口都可以用连接酶进行封口。 图 4 BanHI-KpnI 的接头

(A)Kpn I-BamH I 接头所需要的寡聚核苷酸片段,它的序列同 第一个寡聚核苷酸的序列相同。 (B) BamHI—KpnI 接头片段介导 KpnI 切割的片段连接到 BamHI 切割的载体中。箭头表示可以连接的缺口。打开的环表示 只有经酶促修复后才能连接的缺口。划线部分是两种寡聚核苷酸 的序列 10.λYES(酵母—大肠杆菌穿梭载体)是构建 cDNA 文库的高效载体,这种载体是λ噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒 巧妙结合而成,它兼有病毒和质粒载体的优点。cDNA 被插入载体的质粒部分,然后它能在体外被包装入病毒颗粒中,包装起来的载体感染 大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌,λYES 中的质粒序列能够被诱导重组出λ基因组,并进行独立复制,这就可以 从质粒中分离出来,以便进行进一步的遗传操作。 为了最大限度地提高克隆效率, 载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶 XhoI(5’-C 十 TCGAG)进行切割, 然后在 dTTP 存在的情况下, 同 DNA 聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链 cDNA 同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头连接起来,这两段 寡聚核苷酸的序列是:5’—CGAGATTTACC 和 5’—GGTAAATC,它们的 5’端都是磷酸。然后将载体和 cDNA 混合并连接在一起。采用这 种方法用 2μg 的 7 载体和 0.1μg 的 cDNA,构建了一个有 4×10 个克隆的 cDNA 文库。问: (1)假定载体长为 43kb,cDNA 的平均长度是 lkb,请估计在连接混合物中,载体分子同 cDNA 的比例是多少? (2)在此过程中,载体分子转变成重组体的频率是多少(每对核苷酸的平均分子量 660Da)? (3)说明怎样处理载体和 cDNA 分子,才能把它们连接到一起。处理过的载体本身能自连吗?cDNA 呢? (4)载体和 cDNA 分子要经过怎样的处理才能提高产生重组 DNA 分子的效率? (5)能够用 XhoI 从重组质粒中切出 cDNA 吗? 答: (1)在连接反应混合物中,载体分子和 cDNA 分子的比例大约是 1:2。在长度上载体大约是 cDNA 的 40 倍(43kb:lkb),但在重量上, 载体只有 cDNA 的 20 倍 (2μg 对 0.1μg)。因此,连接混合物中,载体分子的数量只有 cDNA 分子的一半。 (2)2μg 中,载体分子的数目是:4.2×1010

因为这些载体分子得到了 4×10 的重组体,所以产生重组体的效率大约是 0.1% (3)把 XhoI 切割的载体 DNA 与 dTTP 和 DNA 聚合酶一起温育,使每个末端都加上一个 T: 5’—CT 3’-GAGCT 5’—CT 3’-GAGCT 也有同样情况。 (4)载体和 cDNA 修饰之后,载体分子只能同 cDNA 分子连接,反之亦然。由于限制了载体自身的连接,从而大大提高了形成重组体分子的 效率。 (5)修饰的载体末端同接头分子的连接可在载体和 cDNA 的两个结合处重新产生 XhoI 的识别位点(CTCGAG),因此,可用 XhoI 从重组的质 粒 DNA 中切出 cDNA。由于 XhoI 具有 6 个碱基对的识别位点,在 DNA 上切割的频率很低,所以大多数 cDNA 都可以完整地切出来。 11.一个癌基因,从序列上看似乎编码一个转录因子。当放在细胞中表达时,该基因的产物是完全不溶的,这影响了对其功能的直接检测。 免疫染色表明,这种蛋白定位于细胞核内,如同推测的一样,是一种转录因子。如果能够测出它所结合的 DNA 序列,就可以从现有的序列 资料中查找已知基因启动子的天然位点,从而能够找到它所调节的基因。有人建议用 PCR 扩增同该蛋白结合的微量 DNA,思路(图 22.8) 是: (1)合成一组长为 26 个碱基的随机序列的寡聚核苷酸混合体, 在该序列的两侧各有一段 25 个碱基的序列作为 PCR 扩增的引物位点(图 22.8A);(2)把这些寡聚核苷酸加到含有转录因子的细胞粗提取物中,转录因子可以同含有结合位点的寡聚核苷酸结合;(3)用转录因子特异 的抗体分离同转录因子结合的寡聚核苷酸;(4)用 PCR 扩增选择到的寡聚核苷酸进行序列分析。 按照这一思路,用 0.2ng 单

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