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实验四 (2)


实验四:液相色谱法用于不易挥发有机化合物混合物的定性分析
颜菀 20112401139

实验目的:
1、 学习利用高效液相色谱仪分离化合物和检测化合物的含量的方法 2、 通过对样品的定量测定,初步掌握获得高效液相色谱图和数据的一般操作程 序与技术 3、 学习谱图和数据的处理方法

实验原理:
高效液相色谱分离是利用试样中各组分在色谱柱中的流动相和固定相间的分配 系数不同,当试样随流动相进入色谱柱后,组分就在两相间进行反复多次 (103~106)的分配,由于固定相对各种组分的吸附能力不同,各组分在色谱柱 中的运行速度就不同,经过一定柱长后彼此分离,依次从色谱柱流出,通过检测 器时样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

实验仪器与试剂:
仪器:岛津液相色谱仪,SPD-20A 检测器,LC-20AT 泵,微量进样器,C18 色 谱柱 试剂:苯(水杨酸甲酯)浓度为 1000 ppm,甲苯(烟酸乙酯)浓度为 1000 ppm, 3 个不同比例的苯和甲苯(水杨酸甲酯-烟酸乙酯混合液) ,甲醇(AR) ,超纯水

样品的配制:苯和甲苯浓度为 1000ppm 的配置:用移液管分别量取 0.5 mL 的
苯和甲苯用甲醇定容在 5 mL 的容量瓶中(105ppm) ,然后用移液管量取 1 mL 刚 定容的溶液再用甲醇定容在 10mL 的容量瓶后(104ppm)并用移液管量取 1 mL 刚 定容的溶液再用甲醇稀定容在 10mL 的容量瓶中,这样就配制成浓度为 1000ppm, 用 0.45?m 滤膜过滤。 苯-甲苯混合液:用苯和甲苯的浓度为 1000ppm 按体积不同 体积比定容至 10mL

实验步骤:
1、准备 1.1 准备所需的流动相,用合适的 0.45μm 滤膜过滤,超声脱气 20min。 (这里用

的是流动相是甲醇(B)和超纯水(A),分别用有机相系和水相系的 0.45?m 滤膜过 滤,超声脱气 20min。) 1.2 根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱(注意方向)和定量环。 1.3 配制样品浓度为 1000ppm(也可在平衡系统时配制),用合适的 0.45μ m 滤膜过滤。(苯和甲苯浓度为 1000ppm 的配置:用移液管分别量取 0.5 mL 的苯和甲苯用甲醇定容在 5 mL 的容量瓶中(105ppm) ,然后用移液管量取 1 mL 刚定容的溶液再用甲醇定容在 10mL 的容量瓶后(104ppm)并用移液管量取 1 mL 刚定容的溶液再用甲醇稀定容在 10mL 的容量瓶中,这样就配制成浓度 为 1000ppm,用 0.45?m 滤膜过滤。苯-甲苯混合液:用苯和甲苯的浓度为 1000ppm 按体积不同体积比定容至 10mL) 1.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。 2、开机 接通电源,依次开启不间断电源、B 泵、A 泵、检测器,待泵和检测器自检结 束后,打开打印机、电脑显示器、主机,最后打开色谱工作站(即电脑桌面 上的 CS-Light Real Time Analysis)。 3、参数设定 3.1 波长设定:在检测器显示初始屏幕时,按[func]键接着按[Enter]键,用 数字键输入所需波长值 254nm,按[Enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏 幕。 , w4 3.2 流速设定:在 A 泵显示初始屏幕时,按[func]键,用数字键输入所需的 流速(柱在线时流速一般不超过 1ml/min),按[Enter]键确认。按[CE]键退 出。 3.3 流动相比例设定:在 A 泵显示初始屏幕时,按[conc]键,用数字键输入 流动相 B 的浓度百分数(80%),按[Enter]键确认。按[CE]键退出。 4、更换流动相并排气泡 4.1 将 A/B 管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中; 4.2 逆时针转动 A/B 泵的排液阀 180°,打开排液阀; 4.3 按 A/B 泵的[purge]键, pump 指示灯亮, 泵大约以 9.9ml/min 的流速冲洗, 3min(可设定)后自动停止;

4.4 将排液阀顺时针旋转到底,关闭排液阀。 4.5 如管路中仍有气泡,则重复以上操作直至气泡排尽。 4.6 如按以上方法不能排尽气泡,从柱入口处拆下连接管,放入废液瓶中, 设流速为 5ml/min,按[pump]键,冲洗 3min 后再按[pump]键停泵,重新接上 柱并将流速重设为规定值。 5、平衡系统 5.1 按《N2000 色谱数据工作站操作规程》打开"在线色谱工作站"软件,输入 实验信息并设定各项方法参数后,按下"数据收集"页的 [查看基线] 按钮。 5.2 等度洗脱方式 ; g5 J; Q 5.2.1 按 A 泵的[pump]键,A、B 泵将同时启动,pump 指示灯亮。用检验方法 规定的流动相冲洗系统,一般最少需 6 倍柱体积的流动相。按 A 泵的[pump] 键, B 泵将同时启动, A、 pump 指示灯亮。 用检验方法规定的流动相冲洗系统, 一般最少需 6 倍柱体积的流动相。 5.2.2 检查各管路连接处是否漏液,如漏液应予以排除。 5.2.3 观察泵控制屏幕上的压力值,压力波动应不超过 1MPa。如超过则可初 步判断为柱前管路仍有气泡,按 4.6 操作。 5.2.4 观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min,噪声为<0.001mV 时,可认为系统已达到平衡状态,可以进样。 6、进样 6.1 进样前在 CS-Light Real Time Analysis 中:(1)点击“单次分析”,接 着点击“样品记录”,在样品记录名称中输入所要检测得样品名称,然后点 击“数据文件”选择该样品储存在哪里,最后在“数据储存的文件夹”后面 输入该样品名称,点击确定。(2)在信号采集菜单中设定停止时间(8 min) 和延迟时间(3 min)。 6.2 进样前按检测器[zero]键调零,按软件中 [零点校正] 按钮校正基线零 点,再按一下 [查看基线] 按钮使其弹起。 6.3 用试样溶液清洗注射器,并排除气泡后抽取 20 ?L。 7、数据处理 7.1 在桌面双击“CS-Light Postrum Analysis” ,点击确定按钮后,在“文

件夹目录中”选中该样品记录双击鼠标,在谱图上单击鼠标右键的“显示设 置” ,在“显示设置”中选择“展开色谱”的“时间”填写“0”到“20”后 点击确定 7.2 用鼠标点击“编辑”选择“积分”中的“最小峰面积/高”输入“最小峰 面积值” ,然后又点击“定量”在“定量方法”中选择“面积归一法” ,然后 点击查看。 7.3 复制谱图到 Word 文档,在谱图中点击鼠标右键选择“复制” ;复制数据, 单击鼠标左键全选,然后鼠标右键“复制表格到剪贴板(b)。 ” 8、关闭仪器 分析完毕后,关闭色谱工作站,再自上而下关闭仪器。

实验结果:
图一:甲苯

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

μ V(x100,000)

4.0
峰号 1 组分名

5.0
保留时间 7.436

6.0

7.0
面积% 100.0000

min

表一:甲苯 面积 浓度 1319869.7 0.00000

拖尾因子 1.174

分离度 --

图二:苯

2.0

μ V(x100,000)

1.5

1.0

0.5

0.0
0.0
峰号 1 组分名 苯

2.5
保留时间 4.635

5.0
面积 1435883.3

7.5
浓度/ppm 1000 面积% 100.0000

min

拖尾因子 1.397

图三:混合样一

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

μ V(x100,000)

4.0

5.0

6.0

7.0

min

峰号 1 2

组分名

表三:混合样一 保留时间 面积 浓度 5.934 295979.5 0.00000 7.438 960615.6 0.00000
图四:混合样二

面积% 23.5541 76.4459

拖尾因子 1.229 1.168

分离度 -5.288

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

μ V(x100,000)

4.0

5.0

6.0

7.0

min

表四:混合样二 峰号 1 2 组分名 保留时间 5.930 7.437 面积 291531.6 940238.3 浓度 0.00000 0.00000 面积% 23.6677 76.3323 拖尾因子 1.233 1.178 分离度 -5.306

图五:比较(一)
2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
min μ V(x100,000)

色谱

(上面为混合样一,下面为甲苯)

图六:比较(二)
2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
min μ V(x100,000)

色谱

(上面为混合样二,下面为甲苯) ?

结论:在本实验中,通过色谱图一、二可以知道:苯和甲苯的保留时间分
别是:甲苯为 7.436min,苯为 4.635min,所以在混合色谱中前出峰的是苯, 后出峰的是甲苯; 也可通过图五和图六判断,在图五和图六中,甲苯的峰与 混合物的后出峰的水平位置几乎重合,保留时间相近由此可判断混合物色谱 中的后出峰为甲苯。 (1)在混合液 1 中苯和甲苯的峰面积分别是 295979.5 和 960615.6,质量分

数分别是 23.5541%和 76.4459%;质量比为:0.308 (2)在混合液 2 中苯和甲苯的峰面积分别是 291531.6 和 940238.3,质量分数 分别是 23.6677%和 76.3323%;质量比为:0.306

讨论:
1.液相色谱图都出现不同程度的基线漂移: 答: (1)原因:①柱温波动(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常 影响示差检测器、 电导检测器、 较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器), ②流动相不均匀(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移), ③流通 池被污染或有气体,④检测器出口阻塞(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基 线),⑤流动相配比不当或流速变化,⑥柱平衡慢,特别是流动相发生变化时, ⑦流动相污染、变质或由低品质溶剂配成, (2)解决方法:①控制好柱子和流动 相的温度,在检测器之前使用热交换器,②使用 HPLC 级的溶剂,高纯度的盐和 添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用中使用在线脱气或氦气脱气,③用甲醇 或其他强极性溶剂冲洗流通池。 如有需要, 可以用 1N 的硝酸。 (不要用盐酸) ,

④取出阻塞物或更换管子, ⑤更改配比或流速⑥用中等强度的溶剂进行冲洗,更 改流动相时, 在分析前用 10-20 倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。使用离子对 试剂、缓冲盐更应注意平衡柱,⑦检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及 HPLC 级的溶剂。 2.本实验分离度为 5.288 和 5.306,分离度大于 1.5,分离效果较好,提高分离 度使各个峰容易辨别,主要有三种方法: (1)改变强弱溶剂的比例,在本实验中,用比例为 90%甲醇与水混合时可以清 楚看到峰,就可以缩短实验时间,所以,通过改变溶剂比例可以改变各个峰的间 距及实验时间; (2)改变流动相的组成,通过改变流动相组成改善分离度; (3)更换色谱柱; 3.保留时间漂移: 比较图二与图三图四中苯的保留时间,发现保留时间发生一定程度的漂移,液相 色谱分析时保留时间有时发生漂移的原因和解决办法: 答:① 温度控制不好,解决方法是采用恒温装置,保持柱温恒定。 ② 流动相发生变化, 解决办法是防止流动相发生蒸发、反应,保持流动相的比例 相同。 ③ 柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡关于快速变化问题。



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