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高中生物竞赛——微生物学全套资料


第一章

绪论

第二章 微生物类群与形态结构 第三章 微生物的纯培养和显微技术 第四章 微生物的营养 第五章 微生物的代谢 第六章 微生物的生长繁殖及其控制 第七章 病毒 第八章 微生物的遗传 第九章 微生物生态 第十章 感染与免疫

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第一章 绪论 一 、 微生物学 ⒈定义: 研究微生物在一

定条件下的形态结构,生理生化,遗传变异以及微生物的进化,分 类,生态等生命活动规律及其应用的一门科学。 2.研究对象——微生物 1)微生物与我们 微生物无处不在,我们无时不生活在“微生物的海洋”中。 细菌数亿/g 土壤,土壤中的细菌总重量估计为:10034 × 10 12 吨; 每张纸币带细菌:900 万个 人体体表及体内存在大量的微生物: 皮肤表面:平均 10 万个细菌/平方厘米; 口腔:细菌种类超过 500 种; 肠道:微生物总量达 100 万亿, 粪便干重的 1/3 是细菌,每克粪便的细菌总数为:1000 亿个; 每个喷嚏的飞沫含 4500-150000 个细菌,重感冒患者为 8500 万 少数微生物也是人类的敌人! 鼠疫;天花;艾滋病;疯牛病;埃博拉病毒; 可以说,微生物与人类关系的重要性,你怎么强调都不过分,微生物是一把十分锋利的双 刃剑,它们在给人类带来巨大利益的同时也带来“残忍”的破坏。它给人类带来的利益不仅 是享受,而且实际上涉及到人类的生存。 微生物的特点: (1)体积小, 面积大:测量单位:微米或钠米 杆菌的平均长度:2 微米;1500 个杆菌首尾相连= 一粒芝麻的长度;10-100 亿个 细菌加起来重量 = 1 毫克; 面积/体积比:人 = 1,大肠杆菌 = 30 万; 这样大的比表面积特别有利于它们和周围环境进行物质、能量、信息的交换。微生 物的其它很多属性都和这一特点密切相关。 对 1cm3 固体做 10 倍系列三维分割后的比面值变化

边长 1.0cm 1.0mm 0.1mm 0.01mm 1.0μ m 0.1 μ m 0.01 μ m 1.0nm

立方体数 1 103 106 109 1012 1015 1018 1021

总表面积 6cm2 60cm2 600cm2 6000cm2 6㎡ 60 ㎡ 600 ㎡ 6000 ㎡

比面值 6 60 600 6,000 60,000 600,000 6,000,000 60,000,000

近似对象 豌豆 细小药丸 滑石粉粒 变形虫 球菌 大胶粒 大分子 分子

(2)吸收多 ,转化快: 微生物获取营养的方式多种多样,其食谱之广是动植物完全无法相比的!

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纤维素、木质素、几丁质、角蛋白、石油、甲醇、甲烷、天然气、塑料、酚类、氰化物、 各种有机物均可被微生物作为粮食一头 500 kg 的食用公牛,24 小时生产 0.5 kg 蛋白质, 而同样重量的酵母菌,以质量较次的糖液(如糖蜜)和氨水为原料,24 小时可以生产 50000 kg 优质蛋白质 (3)生长旺,繁殖快 大肠杆菌一个细胞重约 10 –12 克,平均 20 分钟繁殖一代 24 小时后: 4722366500 万亿个后代,重量达到:4722 吨 48 小时后:2.2 × 10 43 个后代,重量达到 2.2 × 10 25 吨 相当于 4000 个地球的重量! (4)适应强,易变异: 抗热:有的细菌能在 265 个大气压,250 ℃的条件下生长;自然界中细菌生长的最高 温度可以达到 113 ℃ ;有些细菌的芽孢,需加热煮沸 8 小时才被杀死; 抗寒:有些微生物可以在―12℃ ~ ―30℃的低温生长; 抗酸碱:细菌能耐受并生长的 pH 范围:pH 0.5 ~ 13 耐渗透压:蜜饯、腌制品,饱和盐水(NaCl, 32%)中都有微生物生长; 抗压力:有些细菌可在 1400 个大气压下生长 个体小、结构简、且多与外界环境直接接触繁殖快、 数量多(突变率:10-5 – 10-10) 短时间内产生大量的变异后代。 (5)分布广,种类多: (6)起源早,发现晚:38 亿年前,生命在海洋中出现 300 多年前人们才真正发现微生物的 存在 26 亿年前,陆地上就可能存在微生物,虽然目前已定种的微生物只有大约 10 万种,远 较动植物为少,但一般认为目前为人类所发现的微生物还不到自然界中微生物总数的 1% 级界宽 (7)休眠长:世界上最古老的活细菌(芽孢) :2.5 亿年 3.在生物界中的地位 Wittaker(1969): 五界系统 Woes(1977,1990): 三原界分类系统,包括细菌,古生菌,真核生物 4.内容及分科

微生物学 基础微生物学
按微生物种类分

应用微生物学

按过程或功能分 按与疾病的关系分 按生态环境分 按技术与工艺分 按应用范围分 微生物生理学 微生物遗传学 微生物生态学 分子微生物学 细胞微生物学 微生物基因组学 流行病学 免疫学
工业微生物学 农业微生物学 医学微生物学 药学微生物学 兽医微生物学 食品微生物学 预防微生物学

微 生 物 学 分 类

细菌学 真菌学 病毒学 菌物学 藻类学 原生动物学

土壤微生物学 海洋微生物学

分析微生物学 微生物学技术学 发酵微生物学 遗传工程

医学微生物学 环境微生物学
水微生物学 宇宙微生物学

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二、微生物的发现和微生物学的建立和发展 (一)微生物的发现:我国 8000 年前就开始出现了曲蘖酿酒, ;制酱,醋 4000 年前埃及人已学会烘制面包和酿制果酒; 2500 年前发明酿酱、醋,用曲治消化道疾病; 公元六世纪(北魏时期)贾思勰的巨著―齐民要术‖; 公元 2 世纪,张仲景:禁食病死兽类的肉和不清洁食物; 公元前 112 年-212 年间,华佗:―割腐肉以防传染‖; 公元九世纪痘浆法、痘衣法预防天花; 1346 年,克里米亚半岛上的法卡城之战(靼坦人-罗马人); 16 世纪, 古罗巴医生 G.Fracastoro: 疾病是由肉眼看不见的生物(living creatures)引起的; 1641 年,明末医生吴又可也提出―戾气‖学说 显微镜的发明:列文虎克(荷兰) :1664 年,英国人虎克(Robert Hooke)曾用原始 的显微镜对生长在皮革表面及蔷薇枯叶上的霉菌进行观察, 首次看见并描述微生物:1676 年,微生物学的先驱荷兰人列文虎克(Antony van leeuwenhoek)首次观察到了细菌。他没有上过大学,是一个只会荷兰语的小商人,但却在 1680 年被选为英国皇家学会的会员。列文虎克利用业余时间制造过 400 多架单式显微镜和 放大镜,放大率一般为 50~200 倍。 (二)微生物学的建立和发展
史前期 初创期:列文虎克 、显微镜 1、发展过程 奠基期 发展期

2、微生物学的奠基 成熟期 法国人巴斯德(Louis Pasteur) (1822~1895) (1) 发现并证实发酵是由微生物引起的; (2) 彻底否定了―自然发生‖学说; 著名的曲颈瓶试验无可辩驳地证实,空气内确实含有微生物,是它们引起有机质的腐败。 (3) 免疫学——预防接种 首次制成狂犬疫苗 (4)其他贡献 巴斯德消毒法:60~65℃作短时间加热处理,杀死有害微生物 德国人柯赫(Robert Koch) (1843~1910) (1)微生物学基本操作技术方面的贡献 a)细菌纯培养方法的建立 土豆切面 → 营养明胶 → 营养琼脂(平皿) b)设计了各种培养基,实现了在实验室内对各种微生物的培养 c)流动蒸汽灭菌 (2)对病原细菌的研究作出了突出的贡献: a)具体证实了炭疽杆菌是炭疽病的病原菌 b)发现了肺结核病的病原菌; (1905 年获诺贝尔奖) c)证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则 ——著名的柯赫原则

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柯赫原则 1、 在每一相同病例中都出现这种微生物; 2 、要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来; 3、用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主,同样的疾病会 重复发生; 4 、从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。 3、微生物学发展过程中的重大事件 1890 Von Behring ??制备抗毒素治疗白喉和破伤风 1892 Ivanovsky 提供烟草花叶病毒是由病毒引起的证据; 1928 Griffith 发现细菌转化; 对其机理的研究导致 DNA 是遗传物质的确证;外源遗传物质导入 各种细胞的基因重组技术的建立; 1929 Fleming 发现青霉素; 1944 Avery 等证实转化过程中 DNA 是遗传信息的载体; 1953 Watson 和 Crick ??提出 DNA 双螺旋结构; 1970~1972 Arber、Smith 和 Nathans 发现并提纯了 DNA 限制性内切酶 1977 Woese 提 出 古 生 菌 是 不 同 于 细 菌 和 真 核 生 物 的 特 殊 类 群 Sanger 首次对 f×174 噬菌体 DNA 进行了全序列分析; 1982~1983 ? Prusiner ?发现朊病毒(prion); 1983~1984 ? Mullis 建立 PCR 技术; 1995 第一个独立生活的细菌(流感嗜血杆菌)全基团组序列测定完成; 1996 第一个自养生活的古生菌基因组测定完成 1997 第一个真核生物(啤酒酵母)基因组测序完成 4、20 世纪的微生物学 十九世纪末到二十世纪中期: 微生物学:鉴定病原菌、研究免疫学及其在预防疾病中的作用、寻找化学治疗药物、 分析微生物的化学活性。 普通生物学: 细胞的构造及其在繁殖和发展中的作用、 植物和动物的遗传和进化的机 制。 20 世纪 40 年代后,微生物自身的特点使其成为生物学研究的“明星” ,微生物学很快 与生物学主流汇合,并被推到了整个生命科学发展的前沿,获得了迅速的发展,在生命科学 的发展中作出了巨大的贡献。 微生物学与生物学发展的主流汇合、交叉,获得了全面、深入的发展 5、21 世纪微生物学展望 与其他学科实现更广泛的交叉,获得新的发展学科交叉永远是科学创新的源泉! 微生物基因组的序列测定和分析; 微生物的快速检定; 微量热技术对生命过程的研究 计算机技术与微生物学的结合。 三、 微生物学对生命科学的促进 1. 多学科交叉促进微生物学的全面发展 2. 促进重大理论问题的突破 3. 对生命科学研究技术的贡献

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4.

微生物与人类基因组计划

基础理论:分子遗传学,分子生物学

生命科学

研究技术:动植物细胞培养

,组织培养

基因组计划:模式生物(真核生物,酵母菌)
四、我国微生物学界面临的机遇和挑战

医学 工业 农业

生物工程学

遗传工程(主导) 获得工程菌(工程 细胞工程 细胞柱) 微生物工程(发酵工程) (基础) 酶工程 生物反应器工程 获得产品

思 考 题: ? 试根据微生物的特点,谈谈为什么说微生物既是人类的敌人,更是人类的朋友。

?

为什么说巴斯德和柯赫是微生物学的真正奠基人?

第二章 微生物的纯培养和显微技术 微生物的基本特点:小! 在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究其属性; 微生物的物种(菌株)一般也是以群体的形式进行繁衍、保存; 培养技术在微生物学中具有重要意义! 几个概念: 培养物:微生物学中,在人为规定的条件下培养繁殖得到的微生物群体称为培养物。 混合培养物:含有多种微生物的培养物; 纯培养物:只有一种微生物的培养物; 纯培养技术是进行微生物学研究的基础 微生物个体微小的特点决定了显微技术是进行微生物研究的一项重要技术, 因为绝大多数微 生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。 第一节 微生物的分离和纯培养 从混杂的群体中分离特定的某一种微生物,是研究和利用微生物的第一步。 一、无菌技术
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用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物;在转接、培养微生物时防止其它微 生物的污染。 1、微生物培养的常用器具及其灭菌 常用的器具:试管、瓶子、培养皿等 常用的灭菌方法:高压蒸汽灭菌 高温干热灭菌 2、接种操作:无菌操作。 二、分离纯培养 培养基:液体培养基; 固体培养基; 半固体培养基; 1、用固体培养基分离纯培养 菌落(colony) :单个微生物在适宜的培养基表面或内部生长、繁殖到 一定程度可以形成肉 眼可见的、有一 定形态结构的子细胞生 长群体。 菌苔(lawn):当固体培养基表面众多菌落连成一片时便成为菌苔。 固体培养基分离方法 不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征(形状、颜色 等) ,可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。 同一细菌在不同的培养基平板上形成不同特征的菌落。 固体培养基分离方法包括: 稀释倒平板 涂布平板法 平板划线法 厌氧微生物分离------稀释摇管法

不同形状的菌落

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菌 落 的 培 养 特 征

2、 液体培养基分离方法---------稀释法 稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中, 大多数 (一般应超过 95%) 表现为不生长。 例如:若同一稀释度的试管中有 95%表现为不生长,则 生长的试管中仅含一个细胞的几率为:4.8%; 含二个细胞的几率为:0.12%; 含三个细胞的几率为:0.002% 则:0。048/(0.048+0.0012+0.00002)=0.975 在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为 97.5% 3、单细胞(孢子)分离 一般采用显微操作仪,在显微镜下进行 ? 操作难度与细胞或个体的大小成反比 ? 单细胞(单孢子)分离:可以采取显微分离法从混杂 群体中直接分离单个细胞或单 个个体进行培养以获得纯培养

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4、选择培养分离 用于微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化: 原理:抑制大多数其它微生物的生长;使待分离的微生物生长更快;使待分离的微生物在 群落中的数量上升;使待分离的微生物生长“突出” ,直接挑取待分离的微生物的菌 落获得纯培养。 1) 利用选择平板进行直接分离:根据微生物的特点选择不同的培养条件,使待分离的 微生物生长,其它微生物的生长被抑制,或使待分离的微生物的生长特征明显 不同于其它微生物。 ? 高温下培养:分离嗜热细菌; ? 培养基中不含 N:分离固氮菌; ? 培养基加抗生素:分离抗性菌; ? 牛奶平板:分离蛋白酶产生菌; ? 颜色反应:分离特定的菌株; ? 利用特定细菌的滑动特点进行分离纯化; 2) 富集培养:利用不同微生物间生命活动特点的不同,制定特定的环境条件,使 仅适应于该条件的微生物旺盛生长,待分离微生物在群落中的数量大大增加, 从自然界中分离到所需的特定微生物。 富集培养过程

利用该方法,可根据微生物的特殊要求,从自然界分离出特定已知微生物种类,分离培 养在特定环境中能生长的微生物; 三、二元培养物 培养物中只含有二种微生物, 而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二 元培养物。 如:病毒和宿主细胞;纤毛虫、变形虫和粘细菌。 第二节 显微镜和显微技术 几个基本概念:放大:被观察物越小,放大倍数应越大,否则难以看清! 分辨率:能辨别两点之间最小距离的能力 反差:被观察物区别于背景的程度 与显微镜的自身特点有关, 但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标 本制作和观察技术,这就是显微技术。 一、显微镜的种类及原理 1. 普通光学显微镜

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光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少?为什么? 目镜:10 ~ 15 ╳;物镜: 100 ╳;总放大倍数 1000~1500 ╳; 如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数?其原理? 使用油镜,即在 100 ╳物镜和载玻片之间滴加香柏油; 分辨率(最小可分辨距离)= 0.5λ /n sinθ θ 为物镜镜口角的半数,它取决于物镜的直径和工作距离 n:玻片与物镜间介质的折射率 空气 (n=1.0)、水 (n=1.33)、香柏油 (n=1.52)、玻璃 ( n=1.54) 显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质 用浸没油取代空气的作用: 介质折射率提高 → 数值孔径值和分辨率均得到提高 浸没油与玻璃的折射率相近→很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜,使照明亮度提高,改善观察效果。 光学显微镜物镜的特性
物镜 特性 放大倍数 数值孔径值 焦距(f) 工作距离
450nm 光源(蓝 搜索物镜 4× 0.10 40 mm 17-20 mm 2.3 ?m 低倍镜
10×

高倍镜 40-45× 0.55-0.65 4 mm 0.5-0.7 mm 0.35 ?m

油镜
90-100×

0.25 16 mm 4-8 mm 0.9 ?m

1.25-1.4 1.8-2.0 mm 0.1 mm 0.18 ?m

光)时的分辨率

人眼的分辨能力在 0.2 mm 左右,因此光学显微镜的最大有效放大倍数(使用油镜)是 1,000×到 1,500× 暗视野显微镜 相差显微镜 形成亮背景暗物象的结果 4. 荧光显微镜 5. 透射电子显微镜; 6. 扫描电子显微镜 能否用扫描电镜来观察样品的内部结构,而用透射电镜来观察样品的表面结构? 7. 扫描隧道显微镜 二、显微观察样品的制备 光学显微镜的制样 1. 活体观察:压滴法、悬滴法、菌丝埋片法 1. 染色观察 原因: 加大反差,便于观察 细菌染色法:死菌:正染色:简单染色法 鉴别染色法:革兰氏染色法;抗酸性染色法; 姬姆萨染色法;芽孢染色法; 2. 3.

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负染色:荚膜染色法等 活菌:用美蓝或 TTC(氧化三苯基四氮唑)等做活菌染色 思考题: 1、 为什么说 Koch 等建立的微生物纯培养技术是微生物学建立与发展的基石?一般可用 哪些方法获得微生物的纯培养? 2、微生物的最显著特征就是个体微小,通常只能通过显微镜进行观察。试列举在显微 观察中通过改变样品的反差以改善观察效果的技术及方法。

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第三章 微生物类群与形态结构 第一节 原核微生物 原核微生物的种类 : 真细菌 、放线菌、 蓝细菌、 支原体、 衣原体、 立克次氏体、古细菌 一、真细菌 (一)一般形态 基本形态:球状, 杆状, 螺旋状。 1、球状 细胞个体呈球形或椭圆形, 不同种的球菌在细胞分裂时会形成不同的空间排列方式, 常 被作为分类依据。 (金黄色葡萄球菌,淋病奈瑟氏球菌, 肺炎链球菌) 2、杆状 细胞呈杆状或圆柱形,一般其粗细(直径)比较稳定,而长度则常因培养时间、培养条 件不同而有较大变化。 杆状细菌的排列方式常因生长阶段和培养条件而发生变化,一般不作为分类依据。 如:枯草芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌, 铜绿假单胞菌, 炭疽杆菌,破伤风梭菌 3、螺旋状 弧菌 螺旋菌 螺旋体菌 弧菌:菌体只有一个弯曲,其程度不足一圈,形似“C”字或逗号,鞭毛偏端生。 如:霍乱弧菌, 寄生性弧菌-----蛭弧菌 螺旋菌:菌体回转如螺旋,螺旋数目和螺距大小因种而异,鞭毛二端生,细胞壁坚韧,菌体 较硬。 螺旋体菌:菌体柔软,用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内。如:梅毒密螺旋体 4、其它形状 1)柄杆菌(prosthecate bacteria) 细胞上有柄(stalk) 、菌丝(hyphae) 、附器(appendages)等细胞质伸出物,细胞呈杆状 或梭状,并有特征性的细柄。 一般生活在淡水中固形物的表面,其异常形态使得菌体的表面积与体积之比增加,能有 效地吸收有限的营养物; 2)星形细菌(star-shaped bacteria ) 3)方形细菌(square-ahaped bacteria) 4)异常形态 环境条件的变化: 物理、化学因子的刺激 阻碍细胞正常发育 培养时间过长 细胞衰老 环境条件恢复正常 营养缺乏 异常形态……………………正常形态… 自身代谢产物积累过多 (二)大小 最小:与无细胞结构的病毒相仿(50 nm; ) 最大:肉眼可见(0.75 mm) ; 费氏刺骨鱼菌(0.08 mm x 0.6 mm)(Epulopiscium fishelsoni)比大肠杆菌大 100 万倍 (1985 年发现)

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德国科学家 H. N. Schulz 等 1999 年在纳米比亚海岸的海底沉积物中发现的一种硫 磺细菌(sulfur bacterium) ,其大小可达 0.75 mm,Thiomargarita namibiensis, ---------“纳米比亚硫磺珍珠” 最大和最小细菌的个体大小悬殊:Thiomargarita namibiensis(0.75mm)是 T.nanobacteria(50 nm) 的 10 亿 ~ 100 亿倍。 一般细菌的大小范围:球菌 0.5 ~ 1 ?m (直径) 杆菌 0.2~ 1 ?m (直径) X 1~ 80 ?m (长度) 螺旋菌 0.3~ 1 ?m (直径) X 1~ 50 ?m (长度) (长度是菌体两端点之间的距离,而非实际长度) (三)细胞的结构与功能 一般构造:一般细菌都有的构造。 特殊构造:部分细菌具有的或一般细菌在特殊环境下才有的构造。 1、细胞壁 1)概念:细胞壁(cell wall)是位于细胞表面,内侧紧贴细胞膜的一层较为坚韧,略具弹性 的细胞结构。 2)证实细胞壁存在的方法: (1)细菌超薄切片的电镜直接观察; (2)质、壁分离与适当的染色,可以在光学显微镜下看到细胞壁; (3)机械法破裂细胞后,分离得到纯的细胞壁; (4)制备原生质体,观察细胞形态的变化; 3)细胞壁的功能: (1)固定细胞外形和提高机械强度; (2)为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需; (3)渗透屏障,阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质(分子量大于 800)进入细胞,保 护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤; (4)细菌特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性的物质基础; 4)革兰氏染色与细胞壁: (1)革兰氏染色 细菌染色法:死菌:正染色 :简单染色法 鉴别染色法 革兰氏染色法 抗酸性染色法 芽孢染色法 死菌姬姆萨染色法 负染色: 荚膜染色法等 活菌:用美蓝或 TTC(氧化三苯基四氮唑)等作活菌染色 革兰氏染色 1、用碱性染料结晶紫对菌悬液涂片进行初染; 2、用碘溶液进行媒染,其作用是提高染料和细胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固; 3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌,而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉,细胞呈无色; 4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对涂片进行复染。例如沙黄,它使原来无色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色,而革兰氏阳性细菌继续保持深紫色。

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表 3-1
成分

革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁成分的比较
占细胞壁干重的%
革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌 含量很低(~10) 无 含量较高(~20) 含量较高

肽聚糖 磷壁酸 类脂质 蛋白质

含量很高(50~90) 含量较高(<50) 一般无(<2) 无

(2)革兰氏阳性细菌的细胞壁: 肽聚糖(90%) :聚糖 肽:四尾肽,肽桥 磷壁酸(10%) :壁磷壁酸,膜磷壁酸 周质空间 A、 肽聚糖(peptidoglycan): 又称粘肽(mucopeptide)、胞壁质(murein)或粘质复合物 (mucocomplex),是真细菌 细胞壁中的特有成分。结合在革兰氏阳性细菌细胞壁上的一种酸性多糖 厚约 20~80nm,由 40 层左右的网格状分子交织成的网套覆盖在整个细胞上。 双糖单位中的β -1,4-糖苷键很容易被溶菌酶(lysozyme)所水解,从而引起细菌因肽 聚糖细胞壁的“散架”而死亡。 目前所知的肽聚糖已超过 100 种,在这一“肽聚糖的多样性”中,主要的变化发生 在肽桥上。 B、 磷壁酸: 革兰氏阳性细菌细胞壁上特有的化学成分,主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。 壁磷壁酸:与肽聚糖分子间进行共价结合,用稀酸或稀碱可以提取。跨越肽聚糖层并与细 膜磷壁酸:与细胞膜相交联,又称脂磷壁酸,由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂进行共 价结合后形成,可用 45%热酚水提取,也可用热水从脱脂的冻干细菌中提取。 主要生理功能: ①细胞壁形成负电荷环境,增强细胞膜对二价阳离子的吸收; ②二价阳离子,特别是高浓度的 Mg2+的存在,对于保持膜的硬度,提高细胞膜上需 Mg2+的合成酶的活性极为重要; ③增强某些致病菌对宿主细胞的粘连、避免被白细胞吞噬以及抗补体的作用; ④革兰氏阳性细菌特异表面抗原的物质基础; ⑤噬菌体的特异性吸附受体; (可作为细菌分类、鉴定的依据) ⑥能调节细胞内自溶素(autolysin)的活力,防止细胞因自溶而死亡。 ⑦贮藏磷元素; (3)革兰氏阴性细菌的细胞壁: 例如: 大肠杆菌 肽聚糖(<10%) ; 外膜:脂多糖,磷脂 ; 外膜蛋白(脂蛋白,孔蛋白,其他未知蛋白 ) ; 周质空间;

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A、 肽聚糖:埋藏在外膜层之内,是仅由 1~2 层肽聚糖网状分子组成的薄层(2~3nm); 含量约占细胞壁总重的 10%,故对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性菌弱; 没有特殊的肽桥,只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套; 具内消旋二氨基庚二酸(m-DAP)(只在原核微生物细胞壁上发现) ; B、外膜(outer membrane) :位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层,由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若 干种蛋白质组成的膜,有时也称为外壁。 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) :位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚 (8~10nm)的类脂多糖类物质,由类脂 A、核心多糖(core polysaccharide)和 O特异侧链(O-specific side chain,或称 O-多糖或 O-抗原)三部分组成。 脂多糖的主要功能: ①LPS 结构的多变,决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性; ②LPS 负电荷较强,与磷壁酸相似,也有吸附 Mg2+、Ca2+等阳离子以提高其在细 胞表面浓度的作用,对细胞膜结构起稳定作用。 ③具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能; ④许多噬菌体在细胞表面的吸附受体; ⑤类脂 A 是革兰氏阴性细菌致病物质——内毒素的物质基础; C、外膜蛋白(outer membrane protein):嵌合在 LPS 和磷脂层外膜上的蛋白。 孔蛋白(porins) :是由三个相同分子量(36000)蛋白亚基组成的一种三聚体跨膜蛋白, 中间有一直径约 1nm 的孔道,通过孔的开、闭,可对进入外膜层的物质进行选 择。 非特异性孔蛋白: 可通过分子量小于 800~900 的任何亲水性分子 特异性孔蛋白: 只容许一种或少数几种相关物质通过, 如维生素 B12 和核苷酸等。 脂蛋白(lipoprotein):是一种通过共价键使外膜层牢固地连接在肽聚糖内壁层上的蛋 白,分子量约为 7200。 D、 周质空间(periplasmic space, periplasm),又称壁膜间隙 在革兰氏阴性细菌中,一般指其外膜与细胞膜之间的狭窄空间(宽约 12~15nm) ,呈胶 状。 周质空间是进出细胞的物质的重要中转站和反应场所, 在周质空间中, 存在着多种周质 蛋白(periplasmic proteins) ,如水解酶类;合成酶类;结合蛋白;受体蛋白。 革兰氏阳性和阴性细菌的比较

项 目
1、革兰氏染色反应 2、肽聚糖层 3、磷壁酸 4、外膜 5、脂多糖(LPS) 6、类脂和脂蛋白含量 7、鞭毛结构 8、产毒素 9、对机械力的抗性 10、细胞壁抗溶菌酶 11、对青霉素和磺胺

革兰氏阳性菌
能阻留结晶紫而染成紫色 厚,层次多 多数含有 无 无 低(仅抗酸性细菌含类脂) 基体上着生两个环 以外毒素为主 强 弱 敏感

革兰氏阴性菌
可经脱色而复染成红色 薄,一般单层 无 有 有 高 基体上着生四个环 以内毒素为主 弱 强 不敏感

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5)细胞壁缺陷细菌: 缺壁细菌:实验室或宿主体内形成:缺壁突变------L 型细菌 人工去壁:基本去尽------原生质体(G+) 部分去除------球状体(G-) 在自然界长期进化中形成------支原体 (1)L 型细菌(L-form of bacteria) 细菌在某些环境条件下(实验室或宿主体内)通过自发突变而形成的遗传性稳定 的细胞壁缺陷变异型。 特点:没有完整而坚韧的细胞壁,细胞呈多形态; 有些能通过细菌滤器,故又称“滤过型细菌” ; 对渗透敏感,在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌落(直径在 0.1mm 左右) ; (2)原生质体(protoplast) 在人为条件下, 用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合 成而形成的仅由一层细胞膜包裹的,圆球形、对渗透压变化敏感的细胞,一般由革兰 氏阳性细菌形成。 特点:对环境条件变化敏感,低渗透压、振荡、离心甚至通气等都易引起其破裂; 有的原生质体具有鞭毛,但不能运动,也不被相应噬菌体所感染; 在适宜条件(如高渗培养基)可生长繁殖、形成菌落,形成芽孢。及恢复成有细 胞壁的正常结构。 比正常有细胞壁的细菌更易导入外源遗传物质, 是研究遗传规律和进行原生质体 育种的良好实验材料 (3)球状体(sphaeroplast) ,又称原生质球 采用上述同样方法, 针对革兰氏阴性细菌处理后而获得的残留部分细胞壁 (外壁 层)的球形体。与原生质体相比,它对外界环境具有一定的抗性,可在普通培养基 上生长。 (4)支原体(Mycoplasma) 在长期进化过程中形成的、适应自然生活条件的无细胞壁的原核生物。因它的细 胞膜中含有一般原核生物所没有的甾醇,所以即使缺乏细胞壁,其细胞膜仍有较高的 机械强度。 2、细胞膜 1)概念:细胞质膜(cytoplasmic membrane) ,又称质膜(plasma membrane) 、细胞膜(cell membrane)或内膜(inner membrane) ,是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一 层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜,厚约 7~8nm,由磷脂(占 20%~30%) 和蛋白质(占 50%~70%)组成。 2)观察方法 质壁分离后结合鉴别性染色在光学显微镜下观察; 原生质体破裂; 超薄切片电镜观察; 3)细胞膜的化学组成与结构模型 非极性尾则由长链脂肪酸通过酯键连接在甘油的 C1 和 C2 位上组成, 其链长和饱和度因 细菌种类和生长温度而异。 在极性头的甘油 3C 上,不同种微生物具有不同的 R 基,如磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂

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酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇等。 液态镶嵌模型(fluid mosaic model) ①膜的主体是脂质双分子层; ②脂质双分子层具有流动性; ③整合蛋白因其表面呈疏水性,故可“溶”于脂质双分子层的疏水性内层中; ④周边蛋白表面含有亲水基团,故可通过静电引力与脂质双分子层表面的极性头相连; ⑤脂质分子间或脂质与蛋白质分子间无共价结合; ⑥脂质双分子层犹如一“海洋” ,周边蛋白可在其上作“漂浮”运动,而整合蛋白则似“冰 山”状沉浸在其中作横向移动。 4)甾醇类物质 原核生物与真核生物的最大区别就是其细胞膜中一般不含胆固醇,而是含有 hopanoid。 5)细胞膜的功能 ①选择性地控制细胞内、外的营养物质和代谢产物的运送; ②是维持细胞内正常渗透压的屏障; ③合成细胞壁和糖被的各种组分(肽聚糖、磷壁酸、LPS、荚膜多糖等)的重要基地; ④膜上含有氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代谢的酶系,是细胞的产能场所; ⑤是鞭毛基体的着生部位和鞭毛旋转的供能部位; 6)间体(mesosome,或中体) 细胞质膜内褶而形成的囊状构造,其中充满着层状或管状的泡囊。多见于革兰氏阳 性细菌。 3、细胞质和内含物 1) 概念 细胞质(cytoplasm)是细胞质膜包围的除核区外的一切半透明、胶状、颗粒状物质的 总称。含水量约 80%。 细胞质的主要成分为核糖体、贮藏物、多种酶类和中间代谢物、质粒、各种营养物和 大分子的单体等,少数细菌还有类囊体、羧酶体、气泡或伴孢晶体等。 2)颗粒状贮藏物(reserve materials): 贮藏物是一类由不同化学成分累积而成的不溶性沉淀颗粒,主要功能是贮存营养物。 贮藏物: 碳源及能源类;糖原;聚β -羟丁酸(PHB) ;硫粒;藻青素;藻青蛋白; 磷源(异染粒) ;淀粉粒 3)磁小体(megnetosome) 趋磁细菌细胞中含有的大小均匀、数目不等的 Fe3O4 颗粒,外有一层磷脂、蛋白或 糖蛋白膜包裹。 功能是导向作用,即借鞭毛游向对该菌最有利的泥、水界面微氧环境处生活实用前 景,包括生产磁性定向药物或抗体,以及制造生物传感器等 4)羧酶体(carboxysome) 一些自养细菌细胞内的多角形或六角形内含物,其大小与噬菌体相仿,约 10nm,内 含 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶,在自养细菌的 CO2 固定中起着关键作用。 5)气泡(gas vocuoles) 许多光合营养型、无鞭毛运动的水生细菌中存在的充满气体的泡囊状内含物,大小 为 0.2~1.0μ m×75nm,内由数排柱形小空泡组成,外有 2nm 厚的蛋白质膜包裹。 功能:调节细胞比重以使细胞漂浮在最适水层中获取光能、O2 和营养物质

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6)载色体(Chromatophore) 光合细菌进行光和作用的部位相当于绿色植物的叶绿体。 4、核区(nuclear region or area) 原核生物所特有的无核膜结构、无固定形态的原始细胞核。 5、特殊的休眠构造——芽孢 1)概念 某些细菌在其生长发育后期,在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、 抗逆性极强的休眠体,称为芽孢(endospore 或 spore,偶译“内生孢子”。 ) 2)细菌芽孢的特点 ①整个生物界中抗逆性最强的生命体,耐高温,抗紫外; ②芽孢是细菌的休眠体,在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞; ③无繁殖功能,一个营养细胞仅形成一个芽孢; 3)芽孢的形成与芽孢的萌发过程 4)芽孢的耐热机制 渗透调节皮层膨胀学说 芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差, 皮层的离子强度很高, 产生极高的渗透压夺 取芽孢核心的水分,结果造成皮层的充分膨胀。核心部分的细胞质却变得高度失水,因 此,具极强的耐热性。 5)研究芽孢的意义 ①是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。 ②产芽孢细菌的保藏多用其芽孢。 ③芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类和鉴定中的重要指标。 6)伴孢晶体(parasporal crystal) 少数芽孢杆菌,例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在其形成芽孢的同时,会在 芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体——δ 内毒素,称为伴孢晶体。 特点:不溶于水,对蛋白酶类不敏感;容易溶于碱性溶剂。 伴孢晶体对 200 多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用,因而可将这类产伴孢晶体 的细菌制成有利于环境保护的生物农药——细菌杀虫剂。 6、细菌细胞壁以外的构造 ——— 糖被(glycocalyx) 1) 概念:包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质。 糖被分为: 荚膜(capsule 或 macrocapsule,大荚膜) 微荚膜(microcapsule) 粘液层(slimelayer) 菌胶团(zoogloea) 2)特点 (1)主要成分是多糖、多肽或蛋白质,尤以多糖居多。经特殊的荚膜染色,特别是负染色 (又称背景染色)后可在光学显微镜清楚地观察到它的存在。 (2)产生糖被是微生物的一种遗传特性,其菌落特征及血清学反应是是细菌分类鉴定的指 标之一。 (3)荚膜等并非细胞生活的必要结构,但它对细菌在环境中的生存有利。 (详见 P 57-58) (4)细菌糖被与人类的科学研究和生产实践有密切的关系。 (详见 P58)

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7、细菌细胞壁以外的构造 ——— 鞭毛(flagellum,复 flagella) 1) 概念: 某些细菌细胞表面着生的一至数十条长丝状、 螺旋形的附属物, 具有推动细菌运动功能, 为细菌的“运动器官” 。 鞭毛长度:15~20μ m;直径:0.01~0.02μ m 2)观察和判断细菌鞭毛的方法 电子显微镜直接观察; 光学显微镜下观察:鞭毛染色和暗视野显微镜; 根据培养特征判断:半固体穿刺、菌落(菌苔)形态; 3)鞭毛的结构及其运动机制 结构:基体(basal body) 钩形鞘(hook) 鞭毛丝(filament) 鞭毛的生长方式是在其顶部延伸 着生方式:单端鞭毛,端生丛毛,周生鞭毛,两端生鞭毛。 4)鞭毛推动细菌运动的特点 (1)速度 一般速度在每秒 20~80μ m 范围;最高可达每秒 100μ m(每分钟达到 3000 倍体长) ; 超过了陆上跑得最快的动物——猎豹猎豹的速度 (每分钟 1500 倍体长或每小时 110 公里) 。 (2)方式 细菌以推进方式做直线运动,以翻腾形式做短促转向运动 (3)细菌的趋避运动 鞭毛的功能是运动,这是原核生物实现其趋性(taxis)即趋向性的最有效方式。 化学趋避运动或趋化作用(chemotaxis) :细菌对某化学物质敏感,通过运动聚集于该 物质的高浓度区域或低浓度区域。 光趋避运动或趋光性(phototaxis) :有的细菌能区别不同波长的光而集中在一定波长 光区内。 趋磁运动或趋磁性(magnetotaxis) ,趋磁细菌根据磁场方向进行分布。 8、细菌细胞壁以外的构造 ——— 菌毛(fimbria,复数 fimbriae) 定义:长在细菌体表的纤细、中空、短直、数量较多的蛋白质类附属物,具有使菌体附 着于物体表面的功能。 每个细菌约有 250~300 条菌毛。 有菌毛的细菌一般以革兰氏阴性致病菌居多, 借助菌毛 可把它们牢固地粘附于宿主的呼吸道、 消化道、 泌尿生殖道等的粘膜上, 进一步定植和致病。 9、细菌细胞壁以外的构造 ———性毛(pili,单数 pilus) 一般见于革兰氏阴性细菌的雄性菌株 (即供体菌) 中, 其功能是向雌性菌株 (即受体菌) 传递遗传物质。有的性毛还是 RNA 噬菌体的特异性吸附受体。 二、放线菌 (一)概念:放线菌是具有菌丝、以孢子进行繁殖、革兰氏染色阳性的一类原核微生物, 属于真细菌范畴。 在形态上具有分枝状菌丝、菌落形态与霉菌相似,以孢子进行繁殖。 介于细菌与丝状真菌之间又接近细菌的一类丝状原核生物。 放线菌实际上是属于细菌范畴内的原核微生物,只不过其细胞形态为分枝状菌丝。 (二)形态与结构 单细胞,大多由分枝发达的菌丝组成;菌丝直径与杆菌类似,约1?m;细胞壁组 成与细菌类似,革兰氏染色阳性(少数阴性) ;细胞的结构与细菌基本相同,按形态

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和功能可分为营养菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。 1、营养菌丝:匍匐生长于培养基内,吸收营养,也称基内菌丝。一般无隔膜,直径 0.2-0.8 ?m ,长度差别很大,有的可产生色素。 2、气生菌丝:营养菌丝发育到一定阶段,伸向空间形成气生菌丝,叠生于营养菌丝上,可 覆盖整个菌落表面。 在光学显微镜下观察, 颜色较深, 直径较粗 (1-1.4 ?m ) , 有的产色素。 3、孢子丝:气生菌丝发育到一定阶段,其上可分化出形成孢子的菌丝,即孢子丝,又称产 孢丝或繁殖菌丝。 其形状和排列方式因种而异, 常被作为对放线菌进行分类的依 据。

(三)生长与繁殖

孢子丝释放孢子

繁殖菌丝 (孢子丝)

孢子在适宜 的条件下萌 发,长出1-3 个芽管

气生菌丝

营养菌丝

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(三)生长与繁殖 凝聚孢子 横隔孢子 孢囊孢子 分生孢子 厚壁孢子

无性孢子

存在多种 孢子形成方式

繁殖方式

菌丝断裂

常见于液体培养中,工业发酵生产 抗生素时都以此法大量繁殖放线菌

细菌的芽孢是休眠体,而放线菌的孢子是繁殖体

(四)菌落形态 能产生大量分枝和气生菌丝的菌种(如链霉菌) 菌落质地致密,与培养基结合紧密,小而不 蔓延,不易挑起或挑起后不易破碎。

菌落形态

不能产生大量菌丝体的菌种(如诺卡氏菌) 粘着力差,粉质,针挑起易粉碎 (五)分布特点及与人类的关系 放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界, 土壤中最多, 其代谢产物使 土壤具有特殊的泥腥味; 能产生大量的、种类繁多的抗生素(其中 90%由链霉菌产生) ; 有的放线菌可用于生产维生素、 酶制剂;此外,在甾体转化、石油脱蜡、烃类发酵、 污水处理等方面也有应用; 少数寄生型放线菌可引起人、动物(如皮肤、脑、肺和脚部感染) 、植物(如马铃 薯和甜菜的疮痂病)的疾病。 三、支原体(Mycoplasma) 、立克次氏体(Rickettsia)和衣原体(Chlamydia) 革兰氏阴性细菌,其大小和特性均介于通常的细菌与病毒之间。 (一)立克次氏体(Rickettsia) 1、概念:立克次氏体是大小介于细菌与病毒之间,类似细菌的专性活细胞内寄生的原核微 生物,具细胞壁,革兰氏染色阴性

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H.T.Ricketts 1909 年,首次发现斑疹伤寒的病原体,并因研究此病而牺牲,1916 年人 们以他的名字命名这类病原体作为纪念。 2、特性 1)某些性质与病毒相近 专性活细胞寄生物,除五日热(战壕热)立克次氏体(Rickettsia wolhynica)外均 不能在人工培养基上生长繁殖;体内酶系不完全,一些必需的养料需从宿主细胞获得; 细胞膜比一般细菌的膜疏松, 使它们有可能容易从宿主细胞获得大分子物质, 但也决定 了它们一旦离开宿主细胞则易死亡。 大小介于病毒与一般细菌之间, 球状体:0.2-0.5 ?m;杆状体:0.3-0.5 x 0.3-2 ?m。 2)特殊生活方式:从一种宿主传至另一宿主。 主要以节肢动物(虱、蜱、螨等)为媒介,寄生在它们的消化道表皮细胞中,然后 通过节肢动物叮咬和排泄物传播给人和其他动物。 有的立克次氏体酿成严重疾病,如人类的流行性斑疹伤寒、羌虫热、Q 热等,并常 伴随着灾害、战争和饥饿,曾长期与人类的痛苦、灾难联系在一起。防治以预防为主。 (二)支原体(Mycoplasma) 1、概念 又称类菌质体,是介于一般细菌与立克次氏体之间的原核微生物。 2、特性 1)无细胞壁,只有细胞膜,细胞形态多变; 2)个体很小,能通过细菌过滤器,被认为是最小的可独立生活的细胞型生物; 球状体:0.2-0.25 ?m,最小达0.1 ?m;丝状体最长可达150 ?m,因细胞柔软且具扭 曲性,致使细胞能通过孔径比自身小得多的过滤器。 3)可进行人工培养,但营养要求苛刻,菌落微小,呈典型的 ―油煎荷包蛋‖形状; 4)一些支原体能引起人类、牲畜、家禽和作物的病害疾病; 5)应用活组织细胞培养病毒或体外组织细胞培养时,常被支原体污染。 (三)衣原体(Chlamydia) 1、概念 介于立克次氏体与病毒之间,能通过细菌滤器,专性活细胞内寄生的一类原核微生物。 2、特性 1)细胞结构与细菌类似; 2)细胞呈球形或椭圆形,直径 0.2-0.3 ?m,能通过细菌滤器; 具有类似的细胞壁,细胞壁内也含有胞壁酸、二氨基庚二酸;70S核糖体也是由30S 和50S二个亚基组成。 3)专性活细胞内寄生; 4)在宿主细胞内生长繁殖具有独特的生活周期,即存在原体和始体两种形态。 ( 5)衣原体广泛寄生于人类、哺乳动物及鸟类,少数致病; 沙眼衣原体是人类砂眼的病原体,甚至引起结膜炎、角膜炎、角膜血管翳等临床 症状,成为致盲的重要原因。 6)衣原体不耐热,60度10分钟即被灭活,但它不怕低温,冷冻干燥可保藏多年。对红 霉素、氯霉素、四环素敏感。 1956年, 我国微生物学家汤飞凡等应用鸡胚卵黄囊接种法, 在国际上首先成功地分离培养 出沙眼衣原体。

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表13-1
特 征 直径(μ m) 可见性 过滤性 革兰氏染色 细胞壁 繁殖方式 培养方法 核酸种类 核糖体 大分子合成 产生 ATP 系统 增殖过程中结 构的完整性 入侵方式 对抗生素 对干扰素

支原体、立克次氏体、衣原体与细菌、病毒的比较
细 菌
0.5-0.2 光学显微镜 不能过滤 阳性或阴性

支 原 体
0.2-0.25 光镜勉强可见 能过滤 阴性 缺 二均分裂 人工培养基 DNA 和 RNA 有 有 有 保持

立克次氏体
0.2-0.5 光学显微镜 不能过滤 阴性 与细菌相似 二均分裂 宿主细胞 DNA 和 RNA 有 进行 有 保持

衣 原 体
0.2-0.3 光镜勉强可见 能过滤 阴性 与细菌相似 二均分裂 宿主细胞 DNA 和 RNA 有 进行 无 保持

病 毒
<0.25 电子显微镜 能过滤 无 无细胞结构 复制 宿主细胞 DNA 或 RNA 无 只利用宿主机器 无 失去

有坚韧的细胞壁 二均分裂 人工培养基 DNA 和 RNA 有 有 有 保持

多样 敏感 某些菌敏感

直接 敏感(青霉素例外) 不敏感

昆虫媒介 敏感 有的敏感

不清楚 敏感 有的敏感

决定宿主细胞性质 不敏感 敏感

四、粘细菌(myxobacteria) 一、概念 粘细菌又名子实粘细菌,是一类具有最复杂的行为模式和生活史的原核微生物。 二、生活史 1、营养细胞:杆状、柔软、缺乏坚硬的细胞壁,无鞭毛,产生粘液,可在固体表面作“滑 行”运动,以分裂方式进行繁殖。 2、子实体:营养细胞发育到一定阶段,在适宜的条件下彼此向对方移动,在一定位置聚集 成团,形成形态各异,肉眼可见的子实体。 粘孢子(mycospore) :单个子实体中可能含有 109 个或更多由某些营养细胞转变而成的休 眠结构,称为粘孢子。 子实体干燥后,可借助风力、水力等到处传播,遇到适宜的环境又萌发成为营养细胞。 在营养生长阶段如果有足够的养料就不形成子实体。 能形成子实体是粘细菌区别于其它原核微生物的最主要标志 五、蛭弧菌(Bdellovibrio) (一)概念 寄生于其它细菌并导致其裂解的一类弧菌,其行为类似噬菌体。 (二)特点 1、鞭毛多为偏端单生; 2、生活方式多样:寄生、兼性寄生,极少数腐生。一般认为后者为突变株; 3、可能成为防治有害细菌的一种有力武器;

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(三)寄生方式 1、高速猛烈碰撞、附着于宿主细胞; 2、100 转/秒以上转速“钻孔” 、收缩、进入宿主细胞的周质空间,同时失去鞭毛; 3、生长繁殖,并使宿主细胞裂解; 六、蓝细菌(Cyanobacteria) 1、概念 也称蓝藻或蓝绿藻(blue-green algae) ,是一类含有叶绿素 a、能以水作为供氢体和电子 供体、通过光合作用将光能转变成化学能、同化 CO2 为有机物质的光合细菌。 2、特性 以前曾归于藻类,因为它和高等植物一样具有光和色素----叶绿素 a,能进行产氧型光 合作用; 形态差异极大,有球状、杆状和丝状等形态; 具有原核生物的典型细胞结构;细胞核无核膜,也不进行有丝分裂,细胞壁含胞壁酸和 二氨基庚二酸,革兰氏染色阴性; 蓝细菌被认为是地球上生命进化过程中第一个产氧的光合生物, 对地球上从无氧到有氧 的转变、真核生物的进化起着里程碑式的作用; 营养极为简单,不需要维生素,以硝酸盐或氨作为氮源,多数能固氮,其异形细胞 (heterocyst)是进行固氮的场所; 无鞭毛,但能在固体表面滑行,进行光趋避运动; 许多种类细胞质中有气泡,使菌体漂浮,保持在光线最充足的地方,以利光合作用。 第二节 古生菌(Archaea) 一、概念的提出 1977 年,Carl Woese 以 16S rRNA 序列比较为依据,提出的独立于真细菌和真核生物之 外的生命的第三种形式。 在分类地位上与真细菌和真核生物并列为三域(Domain) ,并且在进化谱系上更接近真 核生物。 多生活于一些生存条件十分恶劣的极端环境中,例如高温、高盐、高酸等。 原名:古细菌(Archaebacteria) ;后改名:古生菌(Archaea) 古生菌在进化谱系上与真细菌及真核生物相互并列, 且与后者关系更近, 而其细胞构造 却与真细菌较为接近,同属于原核生物。 二、细胞形态 在显微镜下,古生菌与细菌具有类似的个体形态。 三、细胞结构 在细胞的结构与功能上,古生菌既有类似真细菌之处,也有类似真核生物之处,还具有 一些自己独特的特点。 (一)细胞壁 具有与真细菌类似功能的细胞壁;细胞壁的结构和化学成分均差别甚大; 如:细胞壁中没有真正的肽聚糖,而是由多糖(假肽聚糖) 、糖蛋白或蛋白质构成的。 热原体属(Thermoplasma)没有细胞壁; (二)细胞膜 亲水头(甘油)与疏水尾(烃链)间是通过醚键而不是酯键连接的; 细胞膜的化学组分存在多样性;古生菌的细胞质膜中存在着独特的单分子层膜或单、

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双分子层混合膜,而真细菌或真核生物的细胞质膜都是双分子层。 (三)细胞质和内含物 (详见 P319,表 12-2 细菌、古生菌和真核生物的特征比较) 无复杂内膜的细胞器;核糖体为 70 S;有些种类的细胞质中具有有一定功能的颗粒状 内含物。 (四)核区 没有具有核仁、核膜的细胞核,染色体 DNA 为共价闭和环状 第三节 真核微生物

真核微生物:凡是细胞核具有核膜,能进行有丝分裂,细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿 体等细胞器的微小生物。 本节主要内容----------菌物(真菌) : 特点: 1、具有细胞核,进行有丝分裂; 2、细胞质中含有线粒体但没有叶绿体,不进行光合作用,无根、茎、叶的分化; 3、以产生有性孢子和无性孢子二种形式进行繁殖; 4、营养方式为化能有机营养(异养) 、好氧; 5、不运动(仅少数种类的游动孢子有 1-2 根鞭毛) ; 6、种类繁多,形态各异、大小悬殊,细胞结构多样。 一、 霉菌(mold) (一)概念:是一些“丝状真菌”的统称,不是分类学上的名词。霉菌菌体均由分枝或不分 枝的菌丝(hypha)构成。许多菌丝交织在一起,称为菌丝体(mycelium) 。 (二)分布特点及与人类的关系 在自然界分布极广;同人类的生产、生活关系密切,是人类实践活动中最早认识和利 用的一类微生物。 食物、工农业制品的霉变,全世界平均每年由于霉变而不能食(饲)用的谷物约占 2%; 有用物品的生产;风味食品、酒精、抗生素(青霉素、灰黄霉素) 有机酸(柠檬 、 酸、葡萄糖酸、延胡索酸等) 、酶制剂(淀粉酶、果胶酶、纤维素酶等) 维生素、甾体 、 激素等;在农业上用于饲料发酵、植物生长刺激素(赤霉素) 杀虫农药(白僵菌剂)等; 、 腐生型霉菌在自然界物质转化中也有十分重要的作用; 引起动植物疾病;我国在 1950 年发生的麦锈病和 1974 年发生的稻瘟病,使小麦和 水稻分别减产了 60 亿公斤。 (三)形态结构 1、菌丝 据菌丝的功能,霉菌菌丝分为:营养菌丝;气生菌丝;繁殖菌丝。 据有无隔膜,分为:无隔菌丝;有隔菌丝。 霉菌菌丝直径约为 2~10mm,比一般细菌和放线菌菌丝大几到几十倍。

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整个菌丝为长管状单细胞,细胞质 内含有多个核。其生长过程只表现

(三)形态结构 为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多
以及细胞质的增加。

1、菌丝
无隔膜菌丝 细胞形态 有隔膜菌丝

菌丝由横隔膜分隔成成串多细胞, 每个细胞内含有一个或多个细胞 核。有些菌丝,从外观看虽然像 多细胞,但横隔膜上有小孔,使 细胞质和细胞核可以自由流通, 而且每个细胞的功能也都相同。

2、菌丝的特化 对于不同的菌物, 在它们的长期进化过程中, 营养菌丝和气生菌丝对于相应的环境条件有 了高度的适应性, 并明显地表现在产生各种形态和功能不同的特化结构上。 也称菌丝的变态。 1)菌环:菌丝交织成套状 2)菌网:菌丝交织成网状 捕虫菌目 (Zoopagales) 在长期的自然进化中形成的特化结构, 特化菌丝构成巧妙的网, 可以捕捉小型原生动物或无脊椎动物,捕获物死后,菌丝伸入体内吸收营养。 3)附枝:匍匐菌丝、假根(类似树根,吸收营养) ,功能是固着和吸收营养。 4)附着枝:若干寄生真菌由菌丝细胞生出 1-2 个细胞的短枝,以将菌丝附着于宿主上,这 种特殊的结构即附着枝。 5)吸器:一些专性寄生菌物从菌丝上分化出来的旁枝,侵入细胞内分化成指状、球状或丝 状,用以吸收细胞内的营养 6)附着胞:许多植物寄生菌物在其芽管或老菌丝顶端发生膨大,并分泌粘性物,借以牢固 地粘附在宿主的表面,这一结构就是附着胞,附着胞上再形成纤细的针状感染菌 丝,以侵入宿主的角质层而吸取营养。 当感染植物的时候, 这种附着胞牢牢地附着到宿主的叶片表面, 并且通过提高附着 胞内渗透压活性物质的浓度产生巨大的膨压, 射出一钉状结构进入植物细胞, 为真菌的 感染炸开一条通道。 真菌禾生刺盘孢(C. Graminicola)的附着胞的压力为 5.35Mpa;M. grisea 附着胞的 压力 8.0Mpa,相当于我们用高压蒸汽灭菌压力(0.1Mpa)的 50-80 倍。 7)菌核:是一种休眠的菌丝组织。由菌丝密集地交织在一起,其外层较坚硬、色深,内层

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疏松,大多呈白色。 假菌核:是寄生性真菌与宿主共同形成,例如冬虫夏草,真菌寄生于鳞翅目昆虫,使虫体转 变为假菌核,当孢子萌发,虫体死亡,菌自虫体内生长出子实体。含有虫草酸,是名贵 中药。 8)子座:菌丝交织成垫状、壳状等,在子座外或内可形成繁殖器官。 (四)菌落 由粗而长的分枝状菌丝组成,菌落疏松,呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状,比细菌菌落大 几倍到几十倍,有的没有固定大小。 各种霉菌,在一定培养基上形成的菌落大小、形状、颜色等相对稳定,所以菌落特征 也为分类依据之一。 (五)霉菌繁殖方式及生活史 1、繁殖方式:无性孢子,有性孢子,菌丝断片。 1)无性孢子繁殖:不经两性细胞配合,只是营养细胞的分裂或营养菌丝的分化(切 割)而形成新个体的过程。 无性孢子有:厚垣孢子、节孢子、分生孢子、孢囊孢子等。 2)有性孢子繁殖:两个性细胞结合产生新个体的过程。 a)质配:两个性细胞结合,细胞质融合,成为双核细胞,每个核均含单倍染色 体(n+n) 。 b)核配:两个核融合,成为二倍体接合子核,此时核的染色体数是二倍(2n) 。 c)减数分裂:具有双倍体的细胞核经过减数分裂,核中的染色体数目又恢复到 单倍体状态。 霉菌有性孢子繁殖的特点: (a)霉菌的有性繁殖不如无性繁殖那么经常与普遍,多发生在特定条件下,往往在自然条 件下较多,在一般培养基上不常见。 (b)有性繁殖方式因菌种不同而异,有的两条营养菌丝就可以直接结合,有的则由特殊的 性细胞(性器官)--------配子囊或由配子囊产生的配子来相互交配,形成有性孢子。 (c)核配后一般立即进行减数分裂,因此菌体染色体数目为单倍,双倍体只限于接合子。 (d)霉菌的有性繁殖存在同宗配合和异宗配合两种情况。 (e)霉菌的有性孢子包括接合孢子、卵孢子、子囊孢子等。 2、生活史 无性繁殖阶段:菌丝体(营养体)在适宜的条件下产生无性孢子,无性孢子萌发形成新的菌 丝体,多次重复。 有性繁殖阶段:在发育后期,在一定条件下,在菌丝体上分化出特殊性器官(细胞) ,经质 配、核配、减数分裂后形成单倍体孢子,再萌发形成新的菌丝体。 有一些霉菌,至尽尚未发现其生活史中有有性繁殖阶段,这类菌物称为半知菌。

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3、霉菌孢子与细菌芽孢的比较

项目 大小 数目 形态 形成部位 细胞核 功能 抗热性 产生菌

霉菌孢子
大 一条菌丝或一个细胞产多个 形态、色泽多样 可在细胞内或细胞外形成 真核 最重要的繁殖方式 不强,在60-70℃下易杀死 绝大多数种类可以产生

细菌芽孢
小 1个细胞只产1个 形态简单 只在细胞内形成 原核 不是繁殖方式,是抗性构造(休眠方式) 极强,一般100℃数十分钟才能杀死 少数细菌可产生

二、 酵母菌 (一)概念 个体一般以单细胞存在;多数营出芽生殖,也有的裂殖;能发酵糖类产能;细胞壁常含 甘露聚糖;喜在含糖量较高 酸度较大的水环境。 (二)分布及与人类的关系 1、多分布在含糖的偏酸性环境,也称为“糖菌”。如水果、蔬菜、叶子、树皮等处, 及葡萄园和果园土壤中等。 2、重要的微生物资源;酵母菌是人类的第一种“家养微生物” 。 3、重要的科研模式微生物;啤酒酵母(Saccharomyces cerevisae)第一个完成全基因 组序列测定的真核生物(1997) 。 4、有些酵母菌具有危害性;有些酵母菌能引起皮肤、呼吸道、消化道、泌尿生殖道疾 病。 (三)形态结构 1、个体形态 卵圆、圆、圆柱、梨形等单细胞,其细胞直径一般比细菌宽 10 倍左右。 有的酵母菌子代细胞连在一起成为链状,称为假丝酵母 2 细胞结构 细胞的构造: 细胞壁 甘露聚糖;蛋白质;葡聚糖;几丁质;脂质。 细胞膜 细胞核 细胞器 其他细胞构造:大型液泡 (四)菌落特征 与细菌菌落类似,但一般较细菌菌落大且厚,表面湿润,粘稠,易被挑起,多为乳白 色,少数呈红色。 (五)酵母菌的繁殖方式 1、无性繁殖:芽殖 裂殖

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产生无性孢子:厚垣孢子,节孢子,掷孢子。 2、有性繁殖;子囊孢子 酵母菌以形成子囊和子囊孢子的形式进行有性繁殖。 1)两个性别不同的单倍体细胞靠近,相互接触; 2)接触处细胞壁消失,质配; 3)核配,形成二倍体核的接合子: A、以二倍体方式进行营养细胞生长繁殖,独立生活;下次有性繁殖前进行减数分 裂。 B、进行减数分裂,形成4个或8个子囊孢子,而原有的营养细胞就成为子囊。子囊 孢子萌发形成单倍体营养细胞。 3、生活史 酵母菌单倍体和双倍体细胞均可独立存在,有三种类型: 1)营养体只能以单倍体形式存在(核配后立即进行减数分裂) 2)营养体只能以双倍体形式存在(核配后不立即进行减数分裂) 3)营养体既可以单倍体也可以双倍体形式存在,都可进行出芽繁殖。 酵母菌中尚未发现其有性阶段的被称为假酵母 (五)繁殖方式和生活史

3、生活史

思考题 1、试根据细菌细胞结构的特点,分析并举例说明为什么它们能在自然界中分布广泛。 2、细菌、 放线菌、霉菌、酵母菌在繁殖方式上各有什么特点?

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第四章 微生物的营养 基本概念: 营养物质:那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质。 营养:微生物获得和利用营养物质的过程。 营养物质是微生物生存的物质基础,而营养是生物维持和延续其生命形式的一种 生理过程。 第一节 微生物的营养要求 一、微生物细胞的化学组成 微生物细胞:水: 70%-90% 干物质:无机物(盐) 有机物 蛋白质、糖、脂、核酸、维生素等及其降解产物 细胞化学元素组成: 主要元素:碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁等; 微量元素:锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。 微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性” 二、营养物质及其生理功能 微生物与动植物营养要素的比较

动物 (异养) 碳源 氮源 能源 生长因子 无机元素 水分
糖类、脂肪 蛋白质及其降解物 与碳源同 维生素 无机盐 水

微生物
异养 糖、醇、有机酸等 蛋白质及其降解 物、有机氮化物、 无机氮化物、氮 与碳源同 有些需要维生素等 生长因子 无机盐 水 自养 二氧化碳、碳酸盐等 无机氮化物、氮 氧化无机物或利用日 光能 不需要 无机盐 水

绿色植物 (自养)
二氧化碳 无机氮化物 利用日光能 不需要 无机盐 水

1、 碳源: 功能: ?构成机体的细胞物质和代谢产物。 ?为机体提供完成整个生理活动所需要的能量。 2、 氮源: 功能:作为合成细胞物质中含氮物质的原料,一般不作为能源物质。 3、生长因子(定义、功能) 4、无机盐(功能) 6、能源(功能)

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三、微生物的营养类型 据生长所需要的营养物质分为:自养型生物;异养型生物。 据生长过程中所需能量的来源分为:光能营养型;化能营养型。 一般分为四种: 1、光能自养型微生物;2、光能异养型微生物 ; 3、化能自养型微生物;4、化能异养型微生物; 微生物营养类型(Ⅰ)

划分依据 碳源 能源 电子供体

营养类型 自养型(autotrophs) 异养型(heterotrophs) 光能营养型(phototrophs) 化能营养型(chemotrophs) 无机营养型(lithotrophs) 有机营养型(organotrophs)

特点 以CO2 为唯一或主要碳源 以有机物为碳源 以光为能源 以有机物氧化释放的化学能为能源 以还原性无机物为电子供体 以有机物为电子供体

微生物的营养类型(Ⅱ)

营养类型 光能无机自养型 (光能自养型) 光能有机异养型 (光能异养型) 化能无机自养型 (化能自养型)

电子供体 H2、H2S、S 或H2O 有机物
H2、H2S、 Fe2+、NH3 或NO2有机物

碳源 CO2 碳酸盐 有机物
CO2

能源 举例 光能 着色细菌、蓝细菌、藻类
光能 红螺细菌 化学能 氢 细 菌 、 硫 杆 菌 、 亚 硝 化 单 胞 菌 属 (无机物 (Nitrosomonas) 、 甲 烷 杆 菌 属 氧化) (Methanobacterium) 、 醋 杆 菌 属 (Acetobacter) 化学能 假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳酸菌属、真 (有机 菌、原生动物 物氧化)

化能有机异养型 (化能异养型)

有机物

四、微生物的营养类型 1. 光能无机自养型(光能自养型) ?以 CO2 为主要或唯一碳源; ?利用光合作用获取生长所需要的能量; ?以无机物如 H2、H2S、S 等作为供氢体或电子供体,还原 CO2 为细胞物质; 如:藻类、蓝细菌:以水为电子供体(供氢体) ,产氧型的光合作用,合成细胞物质。 红硫细菌:以 H2S 为电子供体(供氢体) ,不产氧光合作用,合成细胞物质,并伴 随有硫元素产生。

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光能 CO2+ 2H2S 光合色素 2. 光能有机异养型(光能异养型) ?不能以 CO2 为主要或唯一的碳源; ?以有机物作为供氢体,利用光能将 CO2 还原为细胞物质; ?生长时多数需要外源的生长因子; 例如:红螺菌属中的一些细菌能利用异丙醇作为供氢体,将 CO2 还原成细胞物质,同时积 累丙酮。 H3C CHOH + CO2 H3C 光合色素 光能 2 CH3C0CH3 +[ CH2O] + H2O [ CH2O] + 2S+ H2O

3. 化能无机自养型(化能自养型) ?以还原态无机物氧化时释放的化学能为能源; ?以 CO2 或碳酸盐作为唯一或主要碳源; ?利用 H2、H2S、Fe2+、NH3 或 NO2-等作为电子供体还原 CO2 成细胞物质。 化能无机自养型只存在于微生物中, 可在完全无机及无光的环境中生长。 它们广泛分布于 土壤及水环境中,参与地球物质循环; 如: 硝化细菌 氢细菌 铁细菌 硫化细菌等 4. 化能有机异养型(化能异养型) ?以有机物氧化过程中释放出的化学能作为能源; ?以有机化合物为主要碳源;如淀粉、糖类、纤维素、有机酸等 ?以有机物为电子供体。 有机物通常既是碳源也是能源;大多数细菌、 菌物、原生动物都是化能有机异养型微生 物;所有致病微生物均为化能有机异养型微生物; 腐生型(metatrophy):可利用无生命的有机物(如动植物尸体和残体)作为碳 寄生型(paratrophy):寄生在活的寄主机体内吸取营养物质,离开寄主就不能生存。 腐生型与寄生型之间的中间类型:兼性腐生型(facultive metatrophy); 兼性寄生型(facultive paratrophy); 不同营养类型之间的界限并非是绝对的! 异养型微生物并非绝对不能利用 CO2;自养型微生物也并非不能利用有机物进行生长; 有些微生物在不同生长条件下生长时,其营养类型也会发生改变; 例如紫色非硫细菌(purple nonsulphur bacteria): 没有有机物时,同化 CO2, 为自养型微生物; 有机物存在时,利用有机物进行生长,为异养型微生物; 光照和厌氧条件下,利用光能生长,为光能营养型微生物; 黑暗与好氧条件下,依靠有机物氧化产生的化学能生长,为化能营养型微生物;

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5. 营养缺陷型 定义:某些菌株发生突变(自然突变或人工诱变)后,失去合成某种(或某些)对该菌株生 长必不可少的物质(通常是生长因子如氨基酸、维生素)的能力,必须从外界环境获得该物质 才能生长繁殖,这种突变型菌株称为营养缺陷型(auxotroph)。相应的野生型菌株称为原养型 (prototroph)。 营养缺陷型菌株经常用来进行微生物遗传学方面的研究。 第二节 培养基 培养基(medium) :人工配制的,适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。 任何培养基都应该具备微生物生长所需要的六大营养要素: 碳源、氮源、无机盐、生长因子、水、能源 需经常规高压蒸汽灭菌: 1.05kg/cm2, 121.3℃,15-30 分钟; 0.56kg/cm2, 112.6℃,15-30 分钟; 其中的某些成分进行分别灭菌;过滤除菌; 一、选用和设计培养基的原则和方法 在微生物学研究和生长实践中,配置合适的培养基是一项最基本的要求。 1、选择适宜的营养物质 培养不同的微生物必须采用不同的培养条件;培养目的不同,原料的选择和配比不同; 实验室的常用培养基: 细菌: 牛肉膏蛋白胨培养基(或简称普通肉汤培养基) ; 放线菌: 高氏 1 号合成培养基; 酵母菌: 麦芽汁培养基; 霉菌: 查氏合成培养基; 实验室一般培养:普通常用培养基; 遗传研究:成分清楚的合成培养基; 生理、代谢研究:选用相应的培养基配方; 例如枯草芽孢杆菌:一般培养:肉汤培养基或 LB 培养基; 自然转化:基础培养基; 观察芽孢:生孢子培养基; 产蛋白酶:以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基; 2、 养物的浓度及配比合适 营养物质的浓度适宜;营养物质之间的配比适宜; 高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长,反而起到 抑制或杀菌作用。 培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的 形成和积累,其中碳氮比(C/N)的影响较大。 如:发酵生产谷氨酸时: 碳氮比为 4/1 时,菌体大量繁殖,谷氨酸积累少; 碳氮比为 3/1 时,菌体繁殖受到抑制,谷氨酸产量则大量增加。

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3、物理、化学条件适宜 1) pH 培养基的 pH 必须控制在一定的范围内,以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢 产物。 通常培养条件:细菌与放线菌:pH7~7.5 酵母菌和霉菌:pH4.5~6 范围内生长 为了维持培养基 pH 的相对恒定,通常在培养基中加入 pH 缓冲剂,或在进行工业发酵 时补加酸、碱。 2) 水活度 定义:在天然环境中,微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。 一般用在一定的温度和压力条件下,溶液的蒸汽压力与同样条件下纯水蒸汽压力之比表 示,即: αw=Pw/Pow 式中 Pw 代表溶液蒸汽压力, Pow 代表纯水蒸汽压力。 纯水α w 为 1.00, 溶液中溶质越多,α w 越小。 微生物一般在α w 为 0.60~0.99 的条件下生长, α w 过低时, 微生物生长的迟缓期延长, 比生长速率和总生长量减少。 微生物不同,其生长的最适α w 不同。 3) 氧化还原电位 氧化还原电位又称氧化还原电势(redox potential) ,是度量某氧化还原系统中的还原剂 释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标,其单位是 V(伏)或 mV(毫伏) 。 就象微生物与 pH 的关系一样,不同类型微生物对氧化还原电位(Ф )的要求不同好氧性 微生物:+0.1 伏以上时可正常生长,以+0.3~+0.4 伏为宜; 厌氧性微生物:低于+0.1 伏条件下生长; 兼性厌氧微生物:+0.1 伏以上时进行好氧呼吸, +0.1 伏以下时进行发酵。 氧化还原电位与氧分压和 pH 有关,也受某些微生物代谢产物的影响。 增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压,或加入氧化剂,从而增加Ф 值; 在培养基中加入抗坏血酸(0.1%) 、硫化氢(0.025%)、半胱氨酸(<0.05%)、谷胱甘肽、 二硫苏糖醇、庖肉等还原性物质可降低Ф 值。 培养基中加入氧化还原指示剂刃天青可对氧化还原电位进行间接测定 4、经济节约 配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份,特别是在发酵工业 中,以降低生产成本。 以粗代精:对微生物来说,各种粗原料营养更加完全,效果更好。而且在经济上也节约。 以“野”代“家” :以野生植物原料代替栽培植物原料,如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀 粉质的野生植物,可以部分取代粮食用于工业发 以废代好:以工农业生产中的废弃物作为培养微生物的原料。 例如,糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液); 乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液); 豆制品工业废液及黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等都 可作为培养基的原料; 废水、废渣(工业用于甲烷发酵) ; 在我国农村,已推广利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。 大量的农副产品或制品,如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生

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饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。 以简代繁:某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方,设法减去 30-50%的黄豆饼粉、25% 的葡萄糖和 20%硫酸铵,结果反而提高了产量。 以烃代粮:以石油或天然气副产品代替糖质原料来培养微生物生产石油蛋白。 将石油产品转化成一些产值更高的高级醇、 脂肪酸、 环烷酸等化工产品和若干合 成物;对石油产品的品质进行改良,如脱硫、脱蜡等。 以纤代糖: 开发利用纤维素这种世界上含量最丰富的可再生资源。 将大量的纤维素农副产品 转变为优质饲料、工业发酵原料、燃料及人类的食品及饮料。 以无机氮代蛋白:以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类非蛋白质或非氨基酸廉价原料用作 发酵培养基的原料,让微生物转化成菌体蛋白质或含氮的发酵产物供人们利用。 5、 心设计、试验比较 进行生态模拟,研究某种微生物的培养条件; 文献查阅,设计特定微生物的培养基配方; 试验比较,确定特定微生物的最佳培养条件; 二、培养基的类型及应用 1. 按成份不同划分 天然培养基(complex medium) :由化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物组成。 合成培养基(synthetic medium) :是由化学成份完全了解的物质配制而成的培养基,也称化 学限定培养基(chemically defined medium) 2. 根据物理状态划分 固体培养基:含 1-2%的琼脂 半固体培养基:含 0.2-0.7%的琼脂 液体培养基:不含凝固剂 凝固剂:琼脂、明胶、硅胶。 3. 按用途划分 1) 基础培养基(minimum medium): 在一定条件下含有某种微生物生长繁殖所需的基本营养 物质的培养基,也称为基本培养基。 2)完全培养基(complete medium):在一定条件下含有某种微生物生长繁殖所需的所有营养 物质的培养基。 牛肉膏蛋白胨培养基就是枯草芽孢杆菌等的完全培养基。 3)加富培养基和富集培养基(enrichment medium):在普通培养基(如肉汤蛋白胨培养基) 中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。 这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。用来培养营养要求比 较苛刻的异养型微生物, 如培养百日咳博德氏菌(Bordetella pertussis)需要含有血液的加 富培养基。 可根据待分离微生物的特点设计培养基,用于从环境中富集和分离某种微生物。 目的微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快, 并逐渐富集而占优势, 从而容易 达到分离该种微生物的目的。 4)鉴别培养基(differential medium):用于鉴别不同类型微生物的培养基;利用特定的化 学反应, 产生明显的特征性变化, 根据这种特征性变化, 将该种微生物与其他 微生物区分开来。 5)选择培养基(selective medium):用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离 出 来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同,在 培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质, 抑制不需要的微生物的生长, 有利于所需微

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生物的生长。 第三节 营养物质进入细胞 一、扩散(diffusion) 二、促进扩散(facilitated diffusion) 三、主动运输(active transport) 6、 膜泡运输(memberane vesicle transport) 一、扩散(diffusion) 特点: ?被动的物质跨膜运输方式,运输速率与膜内外物质的浓度差成正比,由高浓度向低浓度运 输。 ?物质运输过程中不消耗能量,不能进行逆浓度运输。 ?参与运输的物质本身的分子结构不发生变化。 ?非特异性的。 物质跨膜扩散的能力和速率与该物质的性质有关,分子量小、脂溶性、极性小的物质易 通过扩散进出细胞。 扩散并不是微生物细胞吸收营养物质的主要方式,水是唯一可以通过扩散 自由通过原生质膜的分子,脂肪酸、乙醇、甘油、苯、一些气体分子(O2、CO2)及某些氨 基酸在一定程度上也可通过扩散进出细胞。 二、促进扩散(facilitated diffusion) 特点: ?被动的物质跨膜运输方式,运输速率与膜内外物质的浓度差成正比,由高浓度向低浓度运 输。 ?物质运输过程中不消耗能量,不能进行逆浓度运输。 ?参与运输的物质本身的分子结构不发生变化。 ?具有特异性。 通过促进扩散进行跨膜运输的物质需要借助与载体(carrier)的作用才能进入细胞,而且 每种载体只运输相应的物质,具有较高的专一性。 载体只影响物质的运输速率,并不改变该物质在膜内外形成的动态平衡状态; 载体的这种性质类似于酶的作用特征,因此载体蛋白也称为透过酶; 透过酶大都是诱导酶,只有在环境中存在机体生长所需的营养物质时,相应的透过酶才 合成。 三、主动运输(active transport) 特点: ?物质运输过程中消耗能量,能进行逆浓度运输。 ?参与运输的物质本身的分子结构发生或不发生变化。 ?具有特异性。 运输物质所需能量来源:好氧型微生物与兼性厌氧微生物直接利用呼吸能; 厌氧型微生物利用化学能(ATP); 光合微生物利用光能; 嗜盐细菌通过紫膜(purple membrane)利用光能; 类型: a) 初级主动运输(primary active transport)

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次级主动运输(secondary active transport):同向运输(symport);逆向运输(antiport); 单向运输(uniport) c) 基团转位(group translocation) 特点:有一个复杂的运输系统来完成物质的运输; 物质在运输过程中发生化学变化,分子结构改变; 基团转位主要存在于厌氧型和兼性厌氧型细菌中, 主要用于糖的运输。 脂肪 酸、核苷、碱基等也可通过这种方式运输。 五、膜泡运输(memberane vesicle transport) 膜泡运输主要存在于原生动物中,特别是变形虫(amoeba)。 b) 思考题 试比较营养物质进入微物细胞的几种方式的特点。 第五章 微生物的代谢 代谢(metabolism) :细胞内发生的各种化学反应的总称 代谢: 分解代谢(catabolism) 合成代谢(anabolism) 分解代谢 复杂分子 (有机物) 简单小分子 合成代谢 ATP [H]

第一节 微生物产能代谢 一切生命活动都是耗能反应,因此,能量代谢是一切生物代谢的核心问题。能量代谢的 中心任务, 是生物体如何把外界环境中的多种形式的最初能源转换成对一切生命活动都能使 用的通用能源------ATP。这就是产能代谢。

化能异养微生物 有机物 最初 能源 化能自养微生物 通用能源 (ATP)

还原态无机物

光能营养微生物

日光

一. 生物氧化 生物氧化 :是发生在活细胞内的一切产能氧化反应的总称。亦即分解代谢。 生物氧化与燃烧的比较
比较项目 反应步骤 条件 产能形式 能量利用率 燃烧 一步式快速反应 激烈 热、光 低 生物氧化 顺序严格的系列反应 由酶催化,条件温和 大部分为 ATP 高
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生物氧化的形式: 包括某物质与氧结合、脱氢或脱电子三种 生物氧化的功能:产能(ATP) 、产还原力[H]和产小分子中间代谢物。 生物氧化过程中释放的能量的去向: 被微生物直接利用; 通过能量转换储存在高能化合物 (如 ATP)中;部分能量以热的形式被释放到环境中。 异养微生物利用有机物,自养微生物则利用无机物,通过生物氧化来进行产能代谢。 二.化能异养微生物的生物氧化 根据氧化还原反应中的电子受体的不同将氧化有机物的氧化方式分为: 1.发酵 2.呼吸作用:有氧呼吸;无氧呼吸。 (一) . 发酵(fermentation) 1、定义: 有机物氧化释放的电子直接交底物给本身未完全氧化的某种中间产物,同时释 放能量并产生各种不同的代谢产物。 有机化合物只是部分地被氧化,因此,只释放出一小部分的能量。是一类低效产能反 应;是厌氧条件下进行的生物氧化;是厌氧或兼性厌氧微生物获得能量的方式。 2、由 EMP 途径中丙酮酸出发的发酵 (1)乙醇发酵 (2)乳酸发酵 (3)混酸发酵 (4)丙酮-丁醇发酵、 丁酸发酵 (5)丙酸发酵

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与EMP途径相关的发酵

?

EMP途径的总反应式 C6H12O6 +2Pi + 2ADP +2NAD+
葡萄糖

2丙酮酸 + 2ATP + 2NADH + 2H CH3COCOOH

+

+ 2H2O

已醇 发酵 (同型)

乳酸 发酵 (同型)

混酸 发酵

丙酮-丁醇 发酵(丁 酸发酵

丙酸发酵

ATP

第一次世界大战期间德国主要用“酵母的II型发酵”方法生产甘油,产量:1000吨/月。 目前的甘油生产方法:使用的微生物是 Dunaliella aslina(一种嗜盐藻类) ,生活在盐湖及海 边的岩池等盐浓度很高环境,胞内积累高浓度的甘油从而使细胞的渗透压保持平衡。

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发酵(fermentation) 3%的亚硫酸氢钠(pH7) CO2
NADH 丙酮酸 乙醛 NAD+ 乙醇

乙醇发酵

(磺化羟基乙醛)
NADH 磷酸二羟基丙酮 NAD+ 磷酸甘油
酵母的II 型发酵 甘油 甘油

Saccharomyces cerevisiae厌氧发酵
微生物学与第一次世界大战

不同微生物发酵产物的不同,也是细菌分类鉴定的重要依据。 大肠杆菌:产酸产气(混酸发酵) 丙酮酸裂解生成乙酰 CoA 与甲酸, 甲酸在酸性条件下可进一步裂解生成 H2 和 CO2。 志贺氏菌:产酸不产气(混酸发酵) 丙酮酸裂解生成乙酰 CoA 与甲酸,但不能使甲酸裂解产生 H2 和 CO2。 产气气杆菌:V.P.试验阳性,甲基红试验阴性。 (混酸发酵) 大肠杆菌:V.P.试验阴性,甲基红试验阳性。 (混酸发酵) V.P.试验

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2. 呼吸作用 定义:微生物在降解底物的过程中,将释放出的电子交给 NAD(P)+、FAD 或 FMN 等 电子载体, 再经电子传递系统传给外源电子受体, 从而生成水或其它还原型产物并 释放出能量的过程,称为呼吸作用。 呼吸作用与发酵作用的根本区别:电子载体不是将电子直接传递给底物降解的中间产物, 而是交给电子传递系统,逐步释放出能量后再交给最终电子受体。 (1)有氧呼吸(aerobic respiration) :以分子氧作为最终电子受体,葡萄糖被彻底氧化生成 CO2 和水,释放大量能量。 (2)无氧呼吸(anaerobic respiration) :以氧化型化合物作为最终电子受体。 某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行无氧呼吸。 无氧呼吸的最终电子受体: 无机物:NO3-、NO2-、SO42-、S2O32-、CO2 等; 有机物:延胡索酸(fumarate)等。 无氧呼吸需要细胞色素等电子传递体,并在能量分级释放过程中伴随有磷酸化作用, 也能产生较多的能量用于生命活动。 无氧呼吸过程中电子经部分电子递体传递给最终电子受体, 所以生成的能量不如有氧 呼吸产生的多。

A.硝酸盐呼吸:以硝酸盐作为最终电子受体的生物学过程, 也称为硝酸盐的异化作用(Dissimilative) 。

只能接收2个电子,产能效率低; NO2-对细胞有毒;
有些菌可将NO2-进一步将其还原成N2,这个过程称为反硝化作用:

能进行硝酸盐呼吸的细菌被称为硝酸还盐原细菌, 主要生活在土壤和水环境中, 如假单胞 菌、依氏螺菌、脱氮小球菌等。 硝酸盐还原细菌被认为是一种兼性厌氧菌, 无氧但环境中存在硝酸盐时进行厌氧呼吸, 而 有氧时其细胞膜上的硝酸盐还原酶活性被抑制,细胞进行有氧呼吸。

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无氧呼吸 反硝化作用的生态学作用: 土壤及水环境 好氧性机体的呼吸作用 氧被消耗而造成局部的厌氧环境
硝酸盐还原细菌进行厌氧呼吸

土壤中植物能利用的氮 (硝酸盐NO3-)还原成 氮气而消失,从而降低 了土壤的肥力。 松土,排除过多的水分,保 证土壤中有良好的通气条件。 B.其它厌氧呼吸:

反硝化作用在氮素循环中的重要作用 硝酸盐是一种容易溶解于水的物质,通常 通过水从土壤流入水域中。如果没有反硝 化作用,硝酸盐将在水中积累,会导致水 质变坏与地球上氮素循环的中断。

延胡索酸呼吸:兼性厌氧,将延胡索酸还原成琥珀酸,以往都是把琥 珀酸的形式作为微生物的一般发酵产物来考虑。实际上在延胡索酸呼吸 中,延胡索酸是最终 电子受体,而琥珀酸是还原产物。 碳酸盐呼吸 硫呼吸 硫酸盐呼吸 厌氧呼吸的产能较有氧呼吸少, 但比发酵多,它使微生物在没有 氧的情况下仍然可以通过电子传 递和氧化磷酸化来产生 ATP,因 此对很多微生物是非常重要的。 除氧以外的多种物质可被各种微 生物用作最终电子受体,充分体 现了微生物代谢类型的多样性。

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三.化能自养微生物的生物氧化 化能无机营养型 : 以无机物为电子供体 从还原态无机物的氧化获得能量

这些微生物一般也能以CO2为唯一或主要碳源合成细胞物质

自养微生物

从对无机物的生物氧化过程中获得生长所 需要能量的微生物一般都是:

化能无机自养型微生物
1、 氨的氧化 (硝化细菌) 某些化能自养细菌可以 NH3、亚硝酸(NO2-)等无机氮化物作为能源。 亚硝化细菌:将氨氧化为亚硝酸并获得能量。 硝化细菌:将亚硝酸氧化为硝酸并获得能量。

?上述两类细菌常伴生在一起, 在它们的共同作用下将铵盐氧化成硝酸盐, 避免亚硝酸积 累所产生的毒害作用。 ? 这类细菌在自然界的氮素循环中也起着重要的作用。 NH3、NO2- 的氧化还原电势均比较高,以氧为电子受体进行氧化时产生的能量较少, 而且进行合成代谢所需要的还原力需消耗 ATP 进行电子的逆呼吸链传递来产生,因此这 类细菌生长缓慢,平均代时在 10h 以上。 2、 硫的氧化 (硫细菌) 硫细菌(sulfur bacteria) :能够利用一种或多种还原态或部分还原态的硫化合物(包 括硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、多硫酸盐和亚硫酸盐等)作为能源。 硫细菌在进行还原态硫物质的氧化时会产酸 (主要是硫酸) 因此它们的生长会显著地 , 导致环境的 pH 下降,有些硫细菌可以在很酸的环境,例如在 pH 低于 1 的环境中生长。 和硝化细菌一样,硫细菌也是通过电子的逆呼吸链传递来生成还原力。 3、 铁的氧化 (铁细菌) 以嗜酸性的氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)为例: 从亚铁到高铁状态的铁的氧化, 对于少数细菌来说也是一种产能反应, 但从这种氧化

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中只有少量的能量可以被利用。因此该菌的生长会导致形成大量的 Fe3+ 。 原因:亚铁(Fe2+) 只有在酸性条件 (pH 低于 3.0) 下才能保持可溶解性和化学稳定; 当 pH 大于 4-5,亚铁(Fe2+)很容易被氧气氧化成为高价铁(Fe3+) ;

氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)在富含 FeS2 的煤矿中繁殖,产生大量的 硫酸和 Fe(OH)3, 从而造成严重的环境污染。 它的生长只需要 FeS2 及空气中的 O2 和 CO2, 因此要防止其破坏性大量繁殖的唯一可行的方法是封闭矿山, 使环境恢复到原来的无氧状 态。 4、 氢的氧化 (氢细菌) 氢是微生物细胞代谢中的常见代谢产物, 很多细菌都能通过对氢的氧化获得生长所需 要的能量。 氢细菌:能以氢为电子供体,以 O2 为电子受体,以 CO2 为唯一碳源进行生长的细菌。

氢的氧化可通过电子和氢离子在呼吸链上的传递产生 ATP 和用于细胞合成代谢所需 要的还原力。 氢细菌都是一些呈革兰氏阴性的兼性化能自养菌。 它们能利用分子氢氧化产生的能量 同化 CO2 ,也能利用其它有机物生长。

产甲烷菌(Methanogenesis)和产已酸菌(Acetogenesis)能以 CO2或碳酸盐为电子受体和碳源进行生长。 这类细菌是严格厌氧菌 化能自养微生物以无机物作为能源,一般产能效率低,生长慢,但从生态学角度看, 它们所利用的能源物质是一般化能异养生物所不能利用的, 因此它们与产能效率高、 生长 快的化能异养微生物之间并不存在生存竞争。 四.能量转换 1、底物水平磷酸化(substrate level phosphorylation) 物质在生物氧化过程中, 常生成一些含有高能键的化合物, 而这些化合物可直接偶联 ATP 或 GTP 的合成。 2、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation) 3、光合磷酸化(photophosphorylation)当一个叶绿素分子吸收光量子时,叶绿素性质上

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即被激活, 导致其释放一个电子而被氧化, 释放出的电子在电子传递系统中的传递过 程中逐步释放能量,这就是光合磷酸化的基本动力。 1)环式光合磷酸化 (1)光合细菌主要通过环式光合磷酸化作用产生 ATP; (2)不是利用 H2O,而是利用还原态的 H2 、 H2S 等作为还原 CO2 的氢供体,进行不产 氧的光合作用; (3)电子传递的过程中造成了质子的跨膜移动,为 ATP 的合成提供了能量; (4)通过电子的逆向传递产生还原力。 2)非环式光合磷酸化 产氧型光合作用,绿色植物、蓝细菌等通过非环式光合磷酸化作用产生 ATP。 非环式光合磷酸化的反应式: 2NADP++2ADP+2Pi+2H2O→2NADPH+2H++2ATP+O2 绿色细菌的非环式光合磷酸化属不产氧型光合作用。 NAD++H2S+ADP+Pi NADPH+H++ATP+S

底物水平磷酸化 化能营养型 氧化磷酸化

光能营养型

通过光合磷酸化将光能转变为 化学能储存于ATP中

3)嗜盐菌紫膜的光合作用 一种只有嗜盐菌才有的,无叶绿素或细菌叶绿素参与的独特的光合作用。 嗜盐菌细胞膜:红色部分(红膜) :主要含细胞色素和黄素蛋白等用于氧化磷酸化的 呼吸链载体。 紫色部分(紫膜) :在膜上呈斑片状(直径约 0.5 mm)独立分布,其总面积约占 细胞膜的一半,主要由细菌视紫红质组成。 四种生理类型的微生物在不同光照和氧下的 ATP 合成
ATP 的合成 微生物 光合细菌 绿藻 兼性厌氧菌(E. coli) 盐生盐杆菌 光照 – + + + 有氧 黑暗 – – + + 光照 + – + + 无氧 黑暗 – – + –

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第二节 微生物的耗能代谢 自学! 第三节 微生物的耗能代谢的调节 自学! 第四节 微生物次级代谢与次级代谢产物 一、次级代谢与次级代谢产物 初级代谢:微生物从外界吸收各种营养物质,通过分解代谢和合成代谢,生成维持生命活 动所必需的物质和能量的过程,称为初级代谢。一类与生物生存有关的、涉及 到产能代谢和耗能代谢的代谢类型,普遍存在于一切生物中。 次级代谢: 某些生物为了避免在初级代谢过程某种中间产物积累所造成的不利作用而产生 的一类有利于生存的代谢类型。 可以认为是某些生物在一定条件下通过突变获 得的一种适应生存的方式。 次级代谢产物:通过次级代谢合成的产物。大多是分子结构比较复杂的化合物。 根据次级代谢产物作用分为:抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等。 初级代谢与次级代谢的关系: 1、存在范围及产物类型不同 初级代谢系统、 代谢途径和初级代谢产物在各类生物中基本相同。 它是一类普遍存在于 各类生物中的一种基本代谢类型。 次级代谢只存在于某些生物(如植物和某些微生物)中,并且代谢途径和代谢产物因生 物的种类不同而不同,就是同种生物也会由于培养条件不同而产生不同的次级代谢产物。 不同的微生物可产生不同的次级代谢产物: 例如某些青霉、 芽孢杆菌和黑曲霉在一定的条件下可以分别合成青霉素、 杆菌肽和 柠檬酸等次级代谢产物。 相同的微生物在不同条件下产生不同的初级代谢产物。 次级代谢产物由少数几种初级代谢过程中产生的中间体或代谢产物衍生而来; 其骨 架碳原子的数量和排列上的微小变化,如氧、氮、氯、硫等元素的加入,或 在产物氧化水平上的微小变化都可以导致产生各种各样的次级代谢产物, 并 且每种类型的次级代谢产物往往是一群化学结构非常相似的不同成分的混 合物。例如,目前已知的新霉素有 4 种,杆菌肽、多粘菌素分别有 10 多种, 而放线菌素有 20 多种等。 2、对产生者自身的重要性不同 次级代谢产物一般对产生者自身的生命活动无明确功能, 不是机体生长与繁殖所必需的 物质,也有人把超出生理需求的过量初级代谢产物也看作是次级代谢产物。 次级代谢产物通常都分泌到胞外, 有些与机体的分化有一定的关系, 并在同其它生物的 生存竞争中起着重要的作用。许多次级代谢产物通常对人类和国民经济的发展有重大影响。 初级代谢产物,如单糖或单糖衍生物、核苷酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大 分子聚合物,蛋白质、核酸、多糖、脂类等通常都是机体生存必不可少的物质,只要在这些 物质的合成过程的某个环节上发生障碍, 轻则引起生长停止、 重则导致机体发生突变或死亡。 次级代谢产物对于产生者本身来说, 不是机体生存所必需的物质, 即使在次级代谢的某 个环节上发生障碍。 不会导致机体生长的停止或死亡, 至多只是影响机体合成某种次级代谢 产物的能力。3、同微生物生长过程的关系明显不同 初级代谢自始至终存在于一切生活的机体中,同机体的生长过程呈平行关系;

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次级代谢则是在机体生长的一定时期内 (通常是微生物的对数生长期末期或稳定期) 产 生的, 它与机体的生长不呈平行关系, 一般可明显地表现为机体的生长期和次级代谢产物形 成期二个不同的时期。 4、环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同 初级代谢产物对环境条件的变化敏感性小(即遗传稳定性大) ,而次级代谢产物对环境条 件变化很敏感,其产物的合成往往因环境条件变化而停止。 5、相关酶的专一性不同 催化次级代谢产物合成的酶往往是一些诱导酶, 这些酶是产生菌在对数生长末期或稳定 生长期里,由于某种中间代谢产物积累而诱导机体合成的一种能催化次级代谢产物合成的 酶,它们通常会因环境条件变化而不能合成。
相对来说催化初级代谢产物合成的酶专一性强,催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强,因此在某种次级代 谢产物合成的培养基中加入不同的前体物时,往往可以导致机体合成不同类型的次级代谢产物。

6、某些机体内存在的二种既有联系又有区别的代谢类型 初级代谢是次级代谢的基础,它可以为次级代谢产物合成提供前体物和所需要的能量; 初级代谢产物合成中的关键性中间体也是次级代谢产物合成中的重要中间体物质; 次级代谢是初级代谢在特定条件下的继续与发展,避免初级代谢过程中某种(或某些) 中间体或产物过量积累对机体产生的毒害作用。 思考题: 不同营养类型的微生物在不同条件下产生 ATP 和还原力的方式与特点.

第六章

微生物的生长繁殖及其控制

基本概念: 1 生长:生物个体物质有规律地、不可逆增加,导致个体体积扩大的生物学过程。 2 繁殖:生物个体生长到一定阶段,通过特定方式产生新的生命个体,即引起生命个体数量 增加的生物学过程。 生长是一个逐步发生的量变过程,繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。 在高等生物里这两个过程可以明显分开, 但在低等特别是在单细胞的生物里, 由于细胞 小,这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。

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一个微生物细胞

合适的外界条件,吸收营养物质,进行代谢。

如果同化作用的速度超过了异化作用

个体的生长 原生质的总量(重量、体积、大小)就不断增加

如果各细胞组分是按恰当的比例增长时,则达到一定程度后 就会发生繁殖,引起个体数目的增加。

群体内各个个体的进一步生长

群体的生长

3 微生物生长: 在一定时间和条件下细胞数量的增加。 在微生物学中提到的“生长” ,一般均指群体生长,这一点与研究大生物时有所不同。 个体生长 → 个体繁殖 → 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖

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第一节

细菌的群体生长繁殖

微生物的特点:

个体微小

肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个 单个的微生物组成的群体。

微生物接种是群体接种,接种后的生长 是微生物群体繁殖生长。 对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础 一、生长曲线 生长曲线(Growth Curve):细菌接种到定量的液体培养基中,定时取样测定细胞数量,以 培养时间为横座标, 以菌数为纵座标作图, 得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变 化规律的曲线。 细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图。 一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期、 对数期、 稳定期和衰亡期等四个生长时期。 1 迟缓期(Lag phase):将少量菌种接入新鲜培养基后,在开始一段时间内菌数不立即增加, 或增加很少,生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。 迟缓期的特点:分裂迟缓、代谢活跃 1)细胞形态变大或增长(一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大) 。 例如: 巨大芽孢杆菌, 在迟缓期末, 细胞的平均长度比刚 接种时长 6 倍。 细胞内 RNA, 尤其是 rRNA 含量增高,合成代谢活跃,核糖体、酶类和 ATP 的合成加快, 易产生诱导酶。 2)生长速率为零。 3)对外界不良条件反应敏感 细胞处于活跃生长中,只是分裂迟缓,在此阶段后期,少数细胞开始分裂,曲线略 有上升。 迟缓期出现的原因:调整代谢 微生物接种到一个新的环境, 暂时缺乏分解和催化有关底物的酶, 或是缺乏充足的中 间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物,就需要一段适应期。 影响其长短的因素:菌种的遗传性;菌龄;转接前后所处的环境条件;接种量。 (短的只需要几分钟,长的需数小时) 在生产实践中缩短迟缓期的常用手段: (1) 通过遗传学方法改变菌种的遗传特性使迟缓期缩短; (2) 利用对数生长期的细胞作为种子;

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(3) 尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大; (4) 适当扩大接种量。 2 对数生长期(Log phase):又称指数生长期(Exponential phase),生长曲线中紧接着迟缓期 的一个细胞以几何级数快速生长的时期。 特点:1)以最大的速率生长和分裂,细菌数量呈对数增加,代时稳定。 2)细菌细胞均衡生长,其个体形态、化学组成和生理特性等均较一致。 3)酶系活跃,代谢旺盛。 此阶段是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子,使微生物发酵的 迟缓期缩短,提高经济效益。

在细菌个体生长里,每个细菌分裂繁殖 一代所需的时间为代时(Generation time) ,在群体生长里细菌数量增加一倍所需 的时间称为倍增时间(Doubling time)。 代时通常以G表示。

t1 – t0 G = —————— n ?? 纳米细菌(nanobacteria) ,三天才分裂一次; 九十年代初期从地下数公里发现的超微型细菌,用代谢产生的 CO2 作指标,计算出这些超 微菌的代谢速率仅为地上正常细菌的 10-15,有人认为它们需要 100 年才能分裂一次。 3 稳定生长期(Stationary phase): (恒定期或最高生长期) ,生长曲线中,紧接着对数期的一 个新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等的时期, 此时, 整个培养物中二 者处于动态平衡。 特点:生长速率降低直至零(即细菌新增殖的细胞数等于细菌死亡数);培养液中活细菌数最 高并维持稳定。 原因:营养物质消耗;代谢产物积累;pH 及氧化还原电位等的变化。 此阶段是细胞重要的分化调节阶段: 储存糖原等细胞质内含物; 芽孢杆菌在此阶段形成 芽孢;发酵过程积累代谢产物的重要阶段;某些放线菌抗生素的大量形成时期。

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生产上常通过补充营养物质(补料)或取走代谢产物、调节 pH、调节温度、对好氧菌 增加通气、 搅拌或振荡等措施延长稳定生长期, 以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产 物。 4)衰亡期(Decline 或 Death phase):营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累,细菌死 亡速率超过新生速率,整个群体呈现出负增长。 该时期死亡的细菌以对数方式增加, 但在衰亡期的后期, 由于部分细菌产生抗性也会 使细菌死亡的速率降低,仍有部分活菌存在。 特点:1)细菌代谢活性降低,细菌衰老并出现自溶,产生或释放出一些产物,如氨基酸、 转化酶、外肽酶或抗生素等。 2)细胞呈现多种形态,有时产生畸形,细胞大小悬殊。 3)有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。 二次生长 不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。 有的物质可直接被利用 (例如葡萄糖或 NH+4 等);有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力(例如乳糖或 NO3-等) 。前者通常称为 速效碳源(或氮源) ,后者称为 迟效碳源(或氮源) 。当培养基中 同时含有这两类碳源(或氮源)时,微生物在生长过程中会形成二次生长现象。 由于采用活菌计数比较麻烦,并要求严格进行操作,否则不易得到准确的结果,重复性 也差,因此在实际工作中多采用分光光度计测定 OD 值的方法绘制细菌的生长曲线。 二、生长的数学模型 比生长速率(specfic growth) :每单位数量的细菌或物质在单位时间内增加的量。 细菌生长的数学模型(比生长速率)

dM ? ?M dN ? ?N (或 dt dt

dE ? ?E dt

;
t1 dN ? ? ?dt t0

对: 或 dN ? ?N dt 积分

?

Nt 1 N0 N

)

N:细胞数量/ml培养液 M:细胞物质的量/ml培养液 E:其他细胞 物 质 的 量 /ml 培

养液 μ N等:菌体产量
μ :比生长速率 t:培养时间

ln Nt ? ln N 0 ? ? (t1 ? t 0)

转化为10为底的 对数

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转化为10为底的对数

lg Nt ? lg N 0 ? ? (t1 ? t 0) ? lg e

ln e 1 ? ln 10 2.303 ? (t1 ? t 0) ? lg Nt ? lg N 0 ? 2.303 ln Nt ? ln N 0 ?? ? ? 2.303 t1 ? t 0 ? lg e ?
代时G与μ 的关系

? ln Nt ? ln N 0 ? ? (t1 ? t 0) Nt ln Nt ? ln N 0 ln N 0 ln 2 ?G ? ? ?

?

?

?

? G ? 0.693/ ?
? ln 2 ? 0.693
三、主要生长参数 ?迟缓时间:微生物生长过程中,在实际条件下达到对数生长期所需时间与理想条件(即无 迟缓期)下达到对数生长期所需时间之差。 ?比生长速率 ?代时 ?世代数 ?总生长量:指在某一时间里,通过培养获得的微生物总量与原来接种的微生物量之差值。 产量常数(K)=总生长量/所消耗基质的总量 影响微生物增代时间(代时)的因素: 1) 菌种,不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同; 2) 营养成分,在营养丰富的培养基中生长代时短; 3) 营养物浓度,在一定范围内,生长速率与营养物浓度呈正比; 4) 温度,在一定范围,生长速率与培养温度呈正相关。 生长限制因子:凡是处于较低浓度范围内,可影响生长速率的营养物成分,就称为生长限制 因子。 四、同步培养 同步培养(Synchronous culture):使群体中的细胞处于比较一致的、生长发育均处于同一阶段 上的培养方法,即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。 同步生长:以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段,并同时进行分裂的生长。

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同步培养物:通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物 获得同步培养的方法: 四、同步培养 离心方法 过滤分离法 硝酸纤维素滤膜法 温度 培养基成份控制 其他(如光照和黑暗交替 培养)

机械方法

环境条件控制技术

同步培养的意义: 同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为 工业发酵的种子,它是一种理想的材料。 硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法 由于细胞的个体差异,同步生长往往只能维持 2-3 个世代,随后又逐渐转变为随机生长。 五、连续培养

将微生物置于一定容积的培养基中,经过培养生长,最后一次收获。

1)分批培养(单批培养) (batch culture) 封闭培养(closed culture)

培养基一次加入,不予补充,不再更换。
2)连续培养(Continous culture ):

在微生物的整个培养期间,通过一定的方式使微生物能以恒定 的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。

培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是 实现微生物连续培养的基本原则。

恒化连续培养: (一) 恒浊连续培养:不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法。 1)测定所培养微生物的光密度值;自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流 速;使培养液维持在某一恒定浊度。

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2)当培养室中的浊度超过预期数值时,流速加快,使浊度降低; 当培养室中的浊度低于预期数值时,流速减慢,使浊度升高;如果所用培养基中有 过量的必需营养物,就可以使菌体维持最高的生长速率。 3)恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的 4)一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业 连续发酵与单批发酵相比的优点: 缩短发酵周期,提高设备利用率;便于自动控制;降低动力消耗及体力劳动强度; 产品质量较稳定; 缺点:杂菌污染和菌种退化。 (二)恒化连续培养:保持培养液有恒定的流速,使培养液中的营养物质浓度保持恒定, 使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。 1)限制性因子:必须是机体生长所必需的营养物质。 氮源:氨基酸和氨等 碳源:葡萄糖、麦芽糖等 无机盐 在一定浓度范围内,限制性因子可决定该机体生长速率。 2)恒化连续培养中,必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度,以作为限制性因 子,而其他营养物均过量。 细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度,并低于最高生长速率。 3)通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物 4)多用于科研,如 遗传学:突变株分离; 生理学:不同条件下的代谢变化; 生态学:模拟自然营养条件建立实验模型;

第二节

环境对生长的影响及生长的测定

一、环境对微生物生长的影响 1 营养物质 2 水的活性——水活度(α w) 3. 温度:(-12℃—100 ℃) 1)温度的影响: ①影响酶活性;②影响细胞质膜的流动性;③影响物质的溶解度 2)生长温度:最低生长温度;最适生长温度;最高生长温度; 致死温度:当温度超过最高生长温度后,致死微生物的最低温度界限。 3)按生长温度范围划分的微生物的类型: 低温型微生物:嗜冷微生物、兼性嗜冷微生物 中温型微生物:嗜温微生物 高温型微生物:嗜热微生物、超嗜热微生物(高温微生物) 二、微生物生长的测定 生长的测定:测定单位时间里微生物数量或生物量(Biomass)的变化。 微生物生长的测定:个体计数;群体重量测定;群体生理指标测定。 目的:1)评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响;

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2)评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果; 3)客观地反映微生物生长的规律。 (一) 以数量变化对微生物生长情况进行测定 通常用来测定细菌、 酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数 量(细菌、孢子、酵母菌) 。 1、 平板菌落计数法 ˙培养平板菌落计数法要求操作熟练、准确,否则难以得到正确的结果; ˙样品充分混匀; ˙每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液; ˙同一稀释度三个以上重复,取平均值; ˙每个平板上的菌落数目合适,便于准确计数; ˙一个菌落可能是多个细胞一起形成,所以在科研中一般用菌落形成单位(colony forming units, CFU)来表示,而不是直接表示为细胞数。 2、 膜过滤培养法 当样品中菌数很低时,可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器, 然后将将膜转到相应的培养基上进行培养,对形成的菌落进行统计。 3、 The most probable number method(液体稀释法) 主要适用于只能进行液体培养的微生物, 或采用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数 的微生物。 对未知样品进行十倍稀释, 然后根据估算取三个连续的稀释度平行接种多支试管, 对 这些平行试管的微生物生长情况进行统计,长菌的为阳性,未长菌的为阴性,然后根据数 学统计计算出样品中的微生物数目。 4、 显微镜直接计数法 比例计数:将已知颗粒浓度的样品(例如血液)与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微 镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。 过滤计数:当样品中菌数很低时,可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过 滤器。然后将滤膜干燥、染色, 并经处理使膜透明,再在显微镜下计算膜上(或 一定面积中)的细菌数; 活菌计数:采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数。 缺点:不能区分死菌与活菌;不适于对运动细菌的计数;需要相对高的细菌浓度;个体 小的细菌在显微镜下难以观察; (二) 以生物量为指标测定微生物的生长 1、比浊法:在一定波长下,测定菌悬液的光密度,以光密度(optical density, 即 O.D.) 值表示菌量。 实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内,否则不准确。 2、重量法:以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量;通过样品中蛋白质、核酸含量的 测定间接推算微生物群体的生物量。 测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法。 3、 生理指标法:微生物的生理指标,如呼吸强度,耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的 规模成正相关。 样品中微生物数量多或生长旺盛, 这些指标愈明显, 因此可以借助特定的仪器如瓦 勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。 常用于对微生物的快速鉴定与检测。

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第三节

微生物生长繁殖的控制

抑制(Inhibition):生长停止,但不死亡。 防腐(Antisepsis):防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长。 化疗(Chemotherapy):杀死或抑制宿主体内的病原微生物。 死亡(Death):生长能力不可逆丧失。 消毒(Disinfection):杀死或灭活病原微生物(营养体细胞) 。 灭菌(Sterilization):利用理化因素杀死包括芽孢在内的所有微生物。 理化因子起抑菌还是杀菌作用的相关因素: 理化因子的强度或浓度;同一浓度理化因子作用时间的长短;不同种类的微生物;同种 微生物的不同生长时期。 一、控制微生物的化学物质 抗微生物剂(Antimicrobial agent) :一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质可 以是人工合成的化合物,也可以是生物合成的天然产物。 抑菌: 抗微生物剂 杀菌 溶菌剂(Bacteriolysis) 待测化学物质 对数生长培养物 抑菌剂(Bacteriostatic agent) 杀菌剂(Bactericide)

定时测定总菌数和活菌数 消毒剂(Disinfectant) 非选择性 (对所有细胞均有毒性) 防腐剂(Antisepsis) 抗微生物剂
抗代谢药物

有选择性 (对病原微生物毒性更强)

抗生素

中草药有效成分 (化学治疗剂)

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液体培养法

化学物质的抗微 生物能力的测定 平板培养法

最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration (MIC) )实验

抑菌圈(zone of inhibition)试验 对杀菌或抑菌作用无法区分

(一)防腐剂和消毒剂 特点:对一切活细胞都有毒性,不能用于人或动物体内的化学治疗。 消毒剂:可杀死微生物,通常用于非生物材料的灭菌或消毒。 防腐剂:能杀死微生物或抑制其生长,但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低,可作 为外用抗微生物药物。 各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准:石炭酸系数 石炭酸系数: 指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效 的石炭酸的最高稀释度的比率。 一般规定处理时间为 10 分钟, 而供试菌定为 Salmonella typhi(伤寒沙门氏菌) 。 石炭酸是在临床上最早使用的消毒剂。 广泛用于一些热敏感的或无法进行高温灭菌的物品或场所的灭菌: 如温度计、 带有 透镜的仪器设备、聚乙烯管或导管等;墙壁、楼板与仪器设备等表面和自来水;空气。 (二)抗代谢物? 定义:某些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似,以至可以和特定的酶结 合,从而阻碍了酶的功能,干扰代谢的正常进行,这些物质称为抗代谢物 (Antimetabolite)。 常见的抗代谢物: 叶酸对抗物(磺胺) 、 嘌呤对抗物(6-巯基嘌呤) 、 苯丙氨酸对抗物(对氟苯丙氨酸) 、 尿嘧啶对抗物(5-氟尿嘧啶) 胸腺嘧啶对抗物(5-溴胸腺嘧啶) 磺胺药物是最早发现, 也是最常见的化学疗剂, 抗菌谱广, 能治疗多种传染性疾病。 对大多数革兰氏阳性细菌(如肺炎球菌、溶血性链球菌等)和某些革兰氏阴性细菌(如 痢疾杆菌、脑膜炎球菌、流感杆菌等)均有作用,对放线菌也有一定的作用。 1934 年,德国 I. G. Farben 染料厂的 G. Domagk 发现一种红色染料(prontosil) ,对 白鼠静脉注射,可治疗因链球菌引起的感染,但在体外却无作用。1935 年,进一步证 明 prontosil 对人的链球菌病也有效。法国人 Trefouel 和英国人 Fuller prontosil 在体内转 化成了具有抑菌作用的磺胺。 磺胺的作用机理: 磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物, 磺胺的抑菌作 用是因为很多细菌需要自己合成叶酸而生长。

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磺胺对人体细胞无毒性,因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶----二氢叶 酸合成酶, 不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸, 而必须直接利用叶酸为生长 因子进行生长。 (三)抗生素? 1、概念 抗生素(Antibiotic):由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物,它们在很 低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动,如杀死微生物或抑制其生长。 自本世纪 40 年代以来,已找到上万种新抗生素,合成了近 10 万种半合成抗生素, 但其中在临床上常用的仅几十种。 2、作用机制 通过抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化和抑制 蛋白质和核酸合成来抑制微生物的生长或杀死它们。 如青霉素因其 b-内酰胺环结构与 D-丙氨酸末端结构相似,从而能占据 D-丙氨酸的 位置与转肽酶结合,并将酶灭活,肽链之间无法彼此连接,抑制了细菌细胞壁的合成。 微生物的抗药性及其机理 3、细菌抗药性的产生 1)抗性菌株特点: ? 细胞质膜透性改变,使抗生素不进入细胞或进入细胞后被细胞主动排出; ? 药物作用靶改变 ? 合成了修饰抗生素的酶 ? 抗性菌株发生遗传变异,导致合成新的多聚体,以取代或部分取代原来的多聚体; 2)避免出现细菌的耐药性的措施: (1)第一次使用的药物剂量要足; (2)避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素; (3)不同的抗生素(或与其他药物)混合使用; (4)对现有抗生素进行改造; (5)筛选新的更有效的抗生素; 二、控制微生物的物理因素 杀灭或抑制微生物的物理因素:温度;辐射作用;过滤;渗透压;干燥;超声波等。 (一) 温度 高温使蛋白质、核酸等重要生物大分子发生变性、破坏,以及破坏细胞膜上的类脂 成分,导致微生物死亡。 高温的杀菌时间与样品中的微生物浓度有关。 当微生物的浓度一致时,可以通过比较热致死时间长短来衡量不同微生物的热敏感 性。 十倍致死时间:在一定温度条件下,微生物数量十倍减少所需要的时间。 热致死时间:在一定温度条件下,杀死所有某一浓度微生物所需要的时间。 高温灭菌 1)干热灭菌法:灼烧灭菌法;干烧灭菌法。利用热空气灭菌。 2)湿热灭菌法:利用热蒸汽灭菌。 湿热比干热灭菌更好:更易于传递热量; 更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构。 湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件:

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多数细菌和真菌的营养细胞:在 60℃左右处理 5-10 分钟; 酵母菌和真菌的孢子:用 80℃以上温度处理; 细菌的芽孢:121℃处理 15 分钟以上; 超高温瞬时灭菌:工业上发酵培养基,135-150℃,5-15 秒; 牛奶或其它液态食品,135-150℃,2-6 秒; (二) 辐射作用 辐射灭菌(Radiation Sterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波 杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。 用于灭菌的电磁波有微波,紫外线(UV)、X-射线和γ -射线等。 思考题: 1 细菌的生长繁殖与高等动植物的有哪些异同? 2 细菌的典型生长曲线可分几期,其划分依据是什么?

第七章 病毒 病毒学(virulogy) :研究病毒(virus)的本质及其与宿主的相互作用的科学,是微生物 学的重要分支学科。极大地丰富了现代生物学(微生物学、分子生物学、分子遗传学)的理 论与技术;有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害;利用病毒对有害生物、特别是害虫 进行生物防治;发展以基因工程为中心的生物高新技术产业。 第一节 概述 一、病毒的特点和定义 1、 特点 1) 不具有细胞结构,具有一般化学大分子的特征。 2)一种病毒的毒粒内只含有一种核酸,DNA 或者 RNA。 3)大部分病毒没有酶或酶系极不完全,不含催化能量代谢的酶,不能进行独立的代谢作用。 4)严格的活细胞内寄生,没有自身的核糖体,没有个体生长,也不进行二均分裂,必须依 赖宿主细胞进行自身的核酸复制,形成子代。 5)个体微小,在电子显微镜下才能看见。 6)对大多数抗生素不敏感,对干扰素敏感。 病毒是一类既具有化学大分子属性, 又具有生物体基本特征; 既具有细胞外的感染性颗 粒形式,又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。是超显微的、没有细胞结构的、 专性活细胞内寄生的实体

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表7-1 单细胞微生物与病毒性质的比较

性质 直径大于 300nm 在无生命培养基生长 专性活细胞内寄生 双分裂 含有 DNA 和 RNA 核酸感染性 核糖体 产能代谢 细胞膜 对抗生素的敏感 对干扰素的敏感
a

细菌 + + + + + + + + -

立克次氏体 + + + + + + + + -

支原体 ± ± ± + + + + + + -

衣原体 ± + + + + + + + -

病毒 + +a -b +

DNA病毒和RNA病毒中的一部分;b

利福平可抑制痘病毒复制?

2、定义 迄今仍无一个科学而严谨的定义。 病毒为具有独立于其宿主的进化史的绝对细胞内寄生物, 它的 DNA 或 RNA 基因组被其 所编码的蛋白质壳体化(encapsidation) -------------( Fields 等,1990 年) 。

(真)病毒:至少含核酸和蛋白质二种组分 非细胞生物 亚病毒 类病毒:只含具侵染性的RNA组分 卫星RNA:只含有不具侵染性的RNA组分 朊病毒:只含蛋白质

二、病毒的宿主范围?

病毒几乎可以感染所有的细胞生物,并具有宿主特异性 噬菌体(细菌) 噬蓝(绿)藻体 支原体噬菌体

原核生物 动物:动物病菌 植物病毒 嗜藻体 真菌病毒

植物

三、病毒的分类和命名

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1 . 分类原则:据病毒性质;抗原性质;生物学性质进行分类。 2 . 命名原则:ICTV 1996年 第十届国际病毒大会(38条新命名原则) 分类等级:目(order)——virales 科(family)——viridae (亚科——virinae) 属(genus)——virus 种(species)种名(命名由少而有意义的词组成) 3 . 分类系统 七大类(包括了4000余种病毒):dsDNA;ssDNA;dsRNA;负意ssRNA;正意ssRNA; DNA和RNA逆转录病毒;亚病毒。 第二节 病毒研究的基本方法 一、病毒的培养--------二元培养物法 1、 噬菌体: 培养液 噬菌体 细菌培养物 营养琼脂平板 细菌平板成为残迹平板 培养液变清亮

噬菌斑(plague) :若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板,经过一定时间培养,在 细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域,即噬菌斑。

2、动物培养物:将动物病毒接种于实验动物、鸡胚或多种细胞培养。 大多数动物病毒感染敏感细胞培养能引起其显微表现的改变,即产生致细胞病变效应 (cytopathic effect,CPE) ,例如:细胞聚集成团、肿大、圆缩、脱落,细胞融合形成多核 细胞,细胞内出现包涵体(inclusion body) ,乃至细胞裂解等。 若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理,病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼 可见的局部病损区域,即蚀斑(plaque)或称空斑。 3、植物培养物:植物病毒接种敏感植物叶片产生坏死斑,或称枯斑。

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二、 病毒纯化 病毒是有感染性的生物体 标准 纯化的病毒制备物应保持其感染性 病毒具有化学大分子的属性 纯化的病毒制备物的理化性质应具有均一性?

主要化学组成为蛋白质
方法

蛋白质提纯方法(盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉 淀、凝胶层析、离子交换等) 差速离心

具有一定的大小、形状和密度 梯度离心 (超速离心)

第三节 毒粒的性质 毒粒(病毒颗粒) :病毒的细胞外颗粒形式,也是病毒的感染性形式。 一、毒粒的形态结构: (一) 、病毒的大小和形状 ? 大小:D<100nm 必需在电镜下观察;不同病毒的毒粒大小差别很大。 ? 形状:球形颗粒;杆状颗粒;复杂形状颗粒;多形性毒粒。 (二) 、病毒的结构 核壳 毒粒 核心:DNA/RNA 壳体(衣壳) :蛋白质

包膜: 脂类、脂蛋白 1、壳体结构: 1)螺旋对称壳体:蛋白质亚基有规律地沿着中心轴(核酸)呈螺旋排列,进而形成高度 有序、对称的稳定结构。 2)二十面体对称壳体:蛋白质亚基围绕具立方对称的正多面体的角或边排列,进而形成 一个封闭的蛋白质的鞘。 3)双对称壳体:具有双对称结构的典型例子是有尾噬菌体(tailed phage),其壳体由头 部和尾部组成。包装有病毒核酸的头部通常呈二十面体对称,尾部呈螺旋对称。 若以一定数目的亚基排列成具有一定表面积的立方对称实体,以二十面体容积为最 大,能包装更多的病毒核酸,所以病毒壳体多取二十面体对称(icosahedral symmetry)结 构。 2 . 包膜

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1)定义: 为脂双层膜,来源于宿主细胞质膜或核膜,其中的细胞膜蛋白被病毒的包膜 糖蛋白取代。 2)病毒的包膜结构 核壳(nucleocapsid) :病毒的蛋白质壳体和病毒核酸(核心)构成的复合物,又称 核衣壳。 裸露毒粒(naked virion) :仅由核衣壳构成的病毒颗粒如烟草花叶病毒、脊髓灰质炎 病毒(Polio virus)等一些简单的病毒的毒粒 包膜 (envelope) 有些病毒的核衣壳包裹着一层脂蛋白膜, : 它是病毒以出芽 (budding) 方式成熟时,由细胞膜衍生而来的。 病毒包膜的结构:病毒包膜的基本结构与生物膜相似,是脂双层膜。在包膜形成时,细 胞膜蛋白被病毒的包膜糖蛋白取代。 包膜突起:凸出于包膜外的包膜糖蛋白结构域。 刺突(spike) :包膜或核衣壳上的突起。 3)包膜的作用:维系毒粒结构,保护病毒核壳:具有抗原性及多种生物学活性,与病毒 感染密切相关(如包膜糖蛋白) 。 3、毒粒的结构类型 裸露的二十面体毒粒; 裸露的螺旋毒粒; 有包膜的二十面体毒粒; 有包膜的螺旋毒粒;

四种主要结构类型

不同病毒的毒粒结构复杂程度有很大的区别 有些病毒,如有尾噬菌体、痘病毒等结构更为复杂,不能包括在这些结构类型之内。

二、 毒粒的化学组成

核酸:DNA或RNA 基本化 学组成 (病毒颗 粒在化学 上表现为 核蛋白) 结构蛋白 蛋白质 非结构蛋白

壳体蛋白 包膜蛋白 毒粒酶

脂类:主要见于包膜,来源于宿主细胞。 糖类:来源于宿主细胞。

1、 病毒的核酸 ? 核酸是病毒的遗传物质; ? 一种病毒的毒粒只含有一种核酸:DNA 或 RNA; 病毒核酸种类:单链 DNA(ss DNA) ;双链 DNA(ds DNA) ; 单链 RNA(ss RNA) ;双链 RNA(ds RNA) ; 某些病毒的 RNA 是双意(ambisense) ,即部分为正极性、部分为负极性。

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不同病毒的核酸均可能具有各自不同的结构特征 2、病毒的蛋白质

非结构蛋白 病毒基因组编码的,在病毒复制过程中产生并 具有一定功能,但并不结合于毒粒中的蛋白质。 结构蛋白 构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必 需的蛋白质

病毒蛋白质

壳体蛋白; 包膜蛋白; 毒粒酶;

1) 构成蛋白质外壳,保护病毒核酸免受核酸酶及其它理化因子的破坏; (壳体蛋白) 2) 决定病毒感染的特异性,与易感细胞表面存在的受体具特异性亲和力,促使病毒粒 子的吸附和入侵; (壳体蛋白、包膜蛋白) 3) 决定病毒的抗原性,能刺激机体产生相应的抗体; (壳体蛋白、包膜蛋白) 4) 构成毒粒酶,参与病毒对宿主细胞的入侵(如 T4 噬菌体的溶菌酶等) ,参与病毒复 制时的病毒大分子的合成(如逆转录酶等) 。 一般来说,病毒是不具酶或酶系极不完全的,所以一旦离开宿主就不能独立进行代 谢和繁殖。 第四节 病毒的复制 病毒的复制:病毒感染敏感宿主细胞后,病毒核酸进入细胞,通过其复制与表达产生子代 病毒基因组和新的蛋白质,然后由这些新合成的病毒组分装配(assembly) 成子代毒粒, 并以一定方式释放到细胞外。 病毒的这种特殊繁殖方式称做复 制(replication) 。

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原料; 能量;

生物合成场所;
毒粒 宿主细胞 有繁殖性的病毒基因组 具有感染性的毒粒消失

病毒核酸和蛋白质

病毒基因组复制、表达

释放至细胞外 装配形成具有感染性的毒粒

一、病毒的复制周期 1、 一步生长曲线(one step growth curve) 研究一步生长曲线的实验方法:1939 年,Max Delbruck & Emory Ellis 建立。 1)用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞; 2)数分钟后,加入抗噬菌体的抗血清(中和未吸附的噬菌体) ; 3)将上述混合物大量稀释,终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感染其它细胞; 4)保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价(对噬菌体含量进行计数) ; 5)以感染时间为横坐标,病毒的感染效价为纵坐标,绘制出病毒特征性的繁殖曲线; 该实验标志着分子病毒学、 分子生物学和分子遗传学的建立 Max Delbruck 因此荣获 1969 年 Nobel Prize。 定义:以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞,待病毒吸附后,离心除去未吸附 的病毒, 或以抗病毒抗血清处理病毒—细胞培养物以建立同步感染, 然后继续培养并 定时取样测定培养物中的病毒效价, 并以感染时间为横坐标, 病毒的感染效价为纵坐 标,绘制出病毒特征性的繁殖曲线,即一步生长曲线。 噬菌体复制(繁殖)的三个阶段: 1)吸附期; 游离的噬菌体吸附到宿主细胞 2)潜伏期(包括隐蔽期) :从噬菌体吸附于细胞到受染细胞释放出新噬菌体的最短时间。不 同病毒的潜伏期长短不同,噬菌体以分钟计,动物病毒和植物病毒以小时或天计。 3)裂解期:随着菌体不断破裂,新噬菌体数目增加,直到最高值。 裂解量:每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目。 噬菌体的裂解量一般为几十到上百个,植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个。 隐蔽期:指自病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间。 一步生长曲线是研究病毒复制的一个经典试验, 最初是为研究噬菌体的复制而建立, 以 后推广到动物病毒和植物病毒的复制研究中。

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1、一步生长曲线(one step growth curve)

取培养物直接测定 病毒数量
将培养物过滤去细 胞后测定病毒数量

将细胞裂解后测定病毒的数量。 前期可将培养物先离心去上清以消除未吸附病毒 的影响

裂解量:每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目。 其值等于潜伏期受染细胞的数目除以稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数 目,即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。

2、 病毒的复制周期 复制周期(replicative circle)或称复制循环:自病毒吸附于细胞开始,到子代病毒从感 染细胞释放到细胞外的病毒复制过程。包括五个阶段,吸附;侵入;脱壳; 病毒大分子的合成(包括病毒基因组的表达与复制) ;装配与释放。 二、病毒感染的起始(包括吸附、侵入、脱壳) 1、吸附:病毒吸附蛋白与宿主细胞表面的特异性受体结合,使病毒吸附于宿主细胞的表面。 两者间的结合力来源于空间结构的互补性,相互间的电荷、氢键、疏水性相互作 用及范得华力。 不同种系的细胞具有不同病毒的细胞受体, 病毒受体的细胞种系特异性决定了病毒 的宿主范围。 2、 侵入: 侵入又称病毒内化, 它是一个病毒吸附后几乎立即发生, 依赖于能量的感染步骤。 不同的病毒-宿主系统的病毒侵入机制不同

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有尾噬菌体:

注射方式将噬菌体核酸注入细胞

吸附

尾钉固着

尾鞘收缩

尾管穿入

DNA注入

通过尾部刺突固着于细胞; 尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖,使细胞壁产生小孔; 尾鞘收缩,核酸通过中空的尾管压入胞内,蛋白质外壳留在胞外; 如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上, 使细胞壁产生许多小孔, 也可引起细胞 立即裂解,但并未进行噬菌体的增殖,这种现象称为自外裂解(lysis from without) 。 植物病毒: 通过因人为地或自然的机械损伤所形成的微伤口进入细胞; 或者靠携带有病 毒的媒介,主要靠有吮吸式口器的昆虫取食将病毒带入细胞。 植物病毒一旦进入细胞后, 增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的运动 蛋白(movement protein)与胞间连丝的相互作用从受染细胞进入邻近细胞。至今仍未 发现植物病毒的细胞受体存在。 动物病毒:①完整病毒穿过细胞膜的移位方式;②细胞的内吞功能;③毒粒包膜与细胞 质膜的融合。 3、脱壳:脱壳是病毒侵入后,病毒的包膜和/或壳体除去而释放出病毒核酸的过程。 脱壳是病毒基因组进行功能表达所必需的感染事件。 T-偶数噬菌体脱壳与侵入是一起发生的 动物病毒存在不同的结构类型和不同的侵入方式,其脱壳过程也较复杂。 病毒的毒粒消失,失去原有的感染性,进入潜隐期。 四、病毒大分子的合成:病毒特异性酶的合成;病毒核酸复制;病毒结构蛋白质合成。

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病毒基因组进入胞内

宿主细胞的代谢发生改变

病毒利用宿主的生物合成机构和场所,使病毒核酸表达和复制, 产生大量的病毒蛋白质和核酸。 病毒基因组的表达与复制存在着强烈的时序性 四、病毒大分子的合成 五、病毒的装配与释放 装配:新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒,称做病毒的装配,亦称成熟 (maturation)或形态发生(morphogenesis) 。 释放:成熟的子代病毒颗粒然后依一定途径释放、裂解、分泌到细胞外 病毒的释放标志病毒复制周期结束。 大多数噬菌体都是以裂解细胞方式释放丝杆噬菌体 (如 M13 或 fd) 不杀死细胞, 子代毒粒以分泌方式不断从受染细胞中释放,并同时完成毒粒的组装。 有包膜病毒的装配与释放有时也是同时完成的; 有包膜的动物病毒是在从宿主细 胞核芽出或细胞质膜芽出的过程中裹上包膜而形成包膜病毒; 烟草花叶病毒的装配: RNA 穿过螺旋的中心孔并在生长端形成一个可移动的环。 第五节 病毒的非增殖性感染 增殖性感染(productive infection) :感染发生在病毒能在其内完成复制循环的允许细胞 内,并以产生有感染性病毒子代颗粒为特征。 非增殖性感染(non ? productive infection) :感染由于病毒、或是细胞的原因,致使病 毒的复制在病毒进入敏感细胞后的某一阶段受阻,结果导致病毒感染的不完全 循环。在此过程中,由于病毒与细胞的相互作用,虽然亦可能导致细胞发生某 些变化,甚至产生细胞病变,但在受染细胞内,不产生有感染性的病毒子代颗 粒。 一、非增值性感染的类型 流产感染(abortive infection) ; 限制性感染(restrictive infection) ; 潜伏感染(latent infection) ; 自学上述概念 二、缺损病毒 讲授“温和噬菌体的溶源性反应” ,其余内容自学。 温和噬菌体的溶源性反应: 烈性噬菌体(virulent phage) 感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞, : 形成裂解循环(lytic cycle)的噬菌体。

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温和噬菌体或称溶源性噬菌体(lysogenic phage) :感染宿主细胞后不能完成复制循环, 噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内,没有成熟噬菌体产生,这一噬菌体称 为温和噬菌体或称溶源性噬菌体。这一现象称做溶源性(lysogeny)现象。 在大多数情况下,温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中(如λ 噬菌体) ,亦 有少数是以质粒形成存在(如 P1 噬菌体) 。 原噬菌体(prophage) :整合于宿主细菌染色体或以质粒形成存在于宿主细胞内的温和 噬菌体基因组称做原噬菌体。 在原噬菌体阶段,噬菌体的复制被抑制,宿主细胞正常地生长繁殖,而噬菌体基因 组与宿主细菌染色体同步复制,并随细胞分裂而传递给子代细胞。 溶源性细菌(lysogenic bacteria: )细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基 因组的细菌称做溶源性细菌。 溶源性细菌经自发裂解或诱发裂解,进入裂解循环。 溶源性感染对细胞的影响: (1)免疫性 被温和噬菌体感染后形成的溶源性细菌具有“免疫性” ,即其它同类噬菌体 虽然可以再次感染该细胞,但不能增殖,也不能导致溶源性细菌裂解。 免疫性是由原噬菌体产生的阻遏蛋白的可扩散性质所决定的。 (2)溶源转变 原噬菌体引起的溶源性细菌除免疫性外的其他的表形改变,包括溶源性细菌细胞表 面性质的改变和致病性转变被称为溶源转变(lysogenic conversion)。 溶源性细菌有时还能获得一些新的生理特性,例如白喉杆菌只有在含有特定 类型的原噬菌体时才能产生白喉毒素,引起被感染机体发病。 第六节 亚病毒因子 一、卫星病毒(satellite viruses) 寄生于与之无关的辅助病毒(heper viruses)的基因产物的病毒。 二、卫星 RNA(sat RNA) 是指一些必须依赖一些辅助病毒进行复制的小分子单链 RNA 片段,它被包 装在辅助病毒的壳体内。 本身对辅助病毒的复制不是必需的, 且他们与辅助病毒的基因 组无明显的同源性。 三、类病毒(virord) 能在免干细胞内自我复制,并不需要辅助病毒。含有 244~375 个核苷酸的的 单链 RNA 分子。 四、朊病毒是一类能引起哺乳动物的亚急性海面样脑病的病原因子。 思考题: 试结合一步生长曲线分析病毒的特点,并与细菌进行比较。 第十一章微生物的遗传 遗传:亲代与子代相似。 变异:亲代与子代、子代间不同个体不完全相同。 遗传(inheritance)和变异(variation)是生命的最本质特性之一。 遗传型:生物的全部遗传因子及基因。 表型(表现型) :具有一定遗传型的个体,在特定环境条件下通过生长发育所表现出来

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的形态等生物学特征的总和。 表型饰变:表型的差异只与环境有关。 特点:暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为。 遗传型变异(基因变异、基因突变) :遗传物质改变,导致表型改变。 特点:遗传性、群体中极少数个体的行为 自发突变频率通常为 10-6---10-9 微生物是遗传学研究中的明星: 微生物细胞结构简单,营养体一般为单倍体,方便建立纯系。 很多常见微生物都易于人工培养,快速、大量生长繁殖。 对环境因素的作用敏感,易于获得各类突变株,操作性强。 第一节 遗传的物质基础 一、DNA作为遗传物质 Griffith的转化实验 (DNA)T2噬菌体感染实验 ; (DNA)植物病毒重建实验 ; (DNA\RNA) 。

二、RNA作为遗传物质

生化提取分别获得含RNA的烟草花叶病 毒蛋白质外壳(病毒1)和核酸(病毒2)
抗血清处理,证明杂种病毒的蛋

白质外壳来自病毒1,而非病毒2

杂种病毒的后代的蛋白质外壳表现 为病毒2,而非病毒1

遗传物质是核酸(RNA)而非蛋白质

三、朊病毒的发现与思考 (一)发现:朊病毒是亚病毒的一种,是一种具有传染性的蛋白质致病因子,迄今为止尚未 发现该蛋白内含有核酸。 致病机理:其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质 PrPc 改变折叠状态为 PrPsc 所致,而这 二种蛋白质的一级结构并没有改变。 引起人 与动物的致死性中枢神 经系统疾病,如羊搔痒 症 (scrapie),牛 海绵状脑 病 (spongiform encephalopathy), 人的库鲁病(kuru)、 克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease, CJD)等。 Stanley B. Prusiner (1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白质侵染颗粒(proteinaceous infectious particle) ,并将之称做 Prion 或 Virino,即朊病毒。1997 年,Stanley B. Prusiner 荣

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获诺贝尔奖。 (二)思考 1) 蛋白质是否可以作为遗传物质?prion 是生命的一个特例?还是仅仅为表达调控的一种 形式? 2) 蛋白质折叠与功能的关系,是否存在折叠密码? 3) DNA→RNA→肽链→蛋白质 第二节 质粒和转座因子 质粒(plasmid) :一种独立于染色体外,能进行自主复制的细胞质遗传因子,主要存在于各 种微生物细胞中。 转座因子 (transposable element) 位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的 DNA 序列, : 广泛分布于原核和真核细胞中。 质粒和转座因子是细胞中除染色体以外的另外二类遗传因子 一、质粒的分子结构 1、 结构 通常以共价闭合环状(covalently closed circle, 简称 CCC)的超螺旋双链 DNA 分子存在于 细胞中;也发现有线型双链 DNA 质粒和 RNA 质粒; 质粒分子的大小:从 1kb 左右到 1000kb, (细菌质粒多在 10kb 以内) 。 2、 质粒的检测 1)提取所有胞内 DNA 后电镜观察; 2)超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察; 3)对于实验室常用菌,可用质粒所带的某些特点,如抗药性初步判断。 对于由于三种构型同时存在时造成的多带现象(提取质粒时造成 或自然存在) ,可以进行特异性单酶切,使其成为一条带。 特定的质粒提取方法和后处理使染色体和 RNA 均被除掉。 二、质粒的主要类型 作用:在某些特殊条件下,质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能;质粒所含的基因对 宿主细胞一般是非必需的,从而使宿主得到生长优势。 根据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应,质粒包括下列主要类型: 致育因子(Fertility factor,F 因子) 抗性因子(Resistance factor,R 因子) 产细菌素的质粒(Bacteriocin production plasmid) 毒性质粒(virulence plasmid) 代谢质粒(Metabolic plasmid) 隐秘质粒(cryptic plasmid 1、 致育因子(Fertility factor,F 因子) 又称 F 质粒,其大小约 100kb,这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象(接合 作用)有关的质粒。 F 因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中,所以又称之为 附加体(episome)。 携带 F 质粒的菌株称为 F+菌株(相当于雄性) ,无 F 质粒的菌株称为 F-菌株(相当于 雌性) 。

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2、 抗性因子(Resistance factor,R 因子) 包括抗药性和抗重金属二大类,简称 R 质粒。 抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。 R100 质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性:汞(mercuric ion ,mer) 、四 环 素 ( tetracycline , tet ) 链 霉 素 (Streptomycin, Str) 、 磺 胺 (Sulfonamide, Su) 、 氯 霉 素 、 (Chlorampenicol, Cm)、夫西地酸(fusidic acid,fus) ,并且负责这些抗性的基因是成簇地存 在于抗性质粒上。 3、 产细菌素的质粒(Bacteriocin production plasmid) 细菌素结构基因、涉及细菌素运输及发挥作用(processing)的蛋白质的基因以及赋予 宿主对该细菌素具有―免疫力‖的相关产物的基因一般都位于质粒或转座子上,因此,细菌素 可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。

细菌素 抑制或杀死近缘,甚至同种不同株的细菌 通过核糖体直接合成的多肽类物质 编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位 于质粒或转座子上 较广的抗菌谱

抗生素

一般是次级代谢产物 一般无直接的结构基因,相关酶的基因多在 染色体上

细菌素一般根据产生菌的种类进行命名: 大肠杆菌(E. coli)产生的细菌素为 colicins(大肠杆菌素) ,而质粒被称为 Col 质粒。 由 G+细菌产生的细菌素或与细菌素类似的因子与 colicins 有所不同,但通常也是由质粒基 因编码,有些甚至有商业价值,例如一种乳酸细菌产生的细菌素 NisinA 能强烈抑制某些 G+ 细菌的生长,而被用于食品工业的保藏。 4、 毒性质粒(virulence plasmid) 许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的, 这些质粒具有编码毒素的基因, 其产 物对宿主(动物、植物)造成伤害。 产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一, 其中许多菌株含有为一种或 多种肠毒素编码的质粒。 苏云金杆菌含有编码δ 内毒素(伴孢晶体中)的质粒 根癌土壤杆菌所含 Ti 质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子。 5、 代谢质粒(Metabolic plasmid) 质粒上携带有有利于微生物生存的基因,如能降解某些基质的酶,进行共生固氮,或产 生抗生素(某些放线菌)等。 降解质粒: 将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式, 环境保 护方面具有重要的意义。 假单胞菌: 具有降解一些有毒化合物, 如芳香簇化合物(苯)、 农药(2,4 ? dichlorophenoxyacetic acid)、辛烷和樟脑等的能力。 6、 隐秘质粒(cryptic plasmid) 隐秘质粒不显示任何表型效应, 它们的存在只有通过物理的方法, 例如用凝胶电泳检测 细胞抽提液等方法才能发现。 它们存在的生物学意义,目前几乎不了解。 在应用上,很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体(一般加上抗性基因) 。

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几个概念: 高拷贝数(high copy number)质粒:每个宿主细胞中可以有10-100个拷贝。也称松弛型质粒 (relaxed plasmid)。 低拷贝数(low copy number)质粒:每个宿主细胞中可以有1-4个拷贝。也称严谨型质粒 (stringent plasmid)。 窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid):只能在一种特定的宿主细胞中复制。 广宿主范围质粒(broad host range plasmid):可以在许多种细菌中复制。 第三节 基因突变及修复 基因突变:一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变。 突变:自发突变:环境因素的影响,DNA复制过程的偶然错误等而导致的突变。一般频率 较低,通常为10-6-10-9 。 诱变:某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用,突变以较高的频率产生。 诱变剂:能使突变率提高到自发突变水平以上的物理、化学和生物因子。 基因突变的特点:1)非对应性;2)稀有性;3)规律性;4)独立性;5)遗传和回复性; 6)可诱变性。 三个经典实验:变量实验;涂布实验;影印实验。 基因突变是重要的生物学现象,它是一切生物变化的根源,连同基因转移、重组一起提 供了推动生物进化的遗传多变性。 一、常见的微生物突变类型 微生物的突变类型 营养缺陷型 抗药性突变型) 条件致死突变型

选择性 突变株 突变株 的表型

非选择 性突变株

形态突变型 抗原突变型 产量突变型

1、营养缺陷型(auxotroph) 定义:一种缺乏合成其生存所必须的营养物(包括氨基酸、维生 0 素、碱基等)的微生物突 变型,只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物(precursor)才能生长。 另一定义:某些菌株发生突变(自然突变或人工诱变)后,失去合成某种(或某些)对该菌株生 长必不可少的物质(通常是生长因子如氨基酸、维生素)的能力,必须从外界环境获得该物 质才能生长繁殖,这种突变型菌株称为营养缺陷型(auxotroph)。 营养缺陷型的表型判断的标准:在基本培养基上能否生长。 营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段 特点:营养缺陷型在选择培养基(一般为基本培养基)上不生长,突变株不能通过选择平板 直接获得属于负选择标记。

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营养缺陷型的表示方法: 基因型:所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示:hisC(组氨酸缺陷型,其中的 大写字母 C 同一表型中不同基因的突变) 表型:同上,但第一个字母大写,且不用斜体:HisC 在具体使用时多用 hisC-和 hisC+,分别表示缺陷型和野生型。 2、抗药性突变型(resistant mutant) 基因突变使菌株对某种或某几种药物,特别是抗生素,产生抗性。 特点:突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的平板上,只有抗性突变能生 长,属于正选择标记 表示方法:用所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示。strr 和 strs 分别表示对 链霉素的抗性和敏感性。 3、 条件致死突变型(conditional lethal mutant) 在某一条件下具有致死效应,而在另一条件下没有致死效应的突变型。 常用的条件致死突变是温度敏感突变,用 ts(temperature ? sensitive)表示,这类突变 在高温下(如 42℃)是致死的,但可以在低温(如 25-30℃)下得到这种突变。 特点:这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因,属于负选择标记。 4、 形态突变型(morphological mutant) 造成形态改变的突变型。 特点:是非选择性突变。突变株和野生型菌株均可生长,但可从形态特征上进行区分。 二、基因突变的分子基础 自发突变 诱发突变:染色体畸变 点突变:碱基置换(直接引起置换,间接引起置换) ;移码突变; 参考生物化学、遗传学 第四节 微生物育种 一、诱变育种:定义 (一)诱变育种的基本环节 出发菌株 诱变 少数存活 少数突变 少数正变 少数幅度大 少数宜投产 (二)诱变育种的几个原则 1 . 选择简便有效的诱变剂; 2 . 挑选优良的出发菌株; 3 . 处理单孢子(或单细胞)悬液; 4 . 选用最适剂量; 5 . 利用符合处理的协同效应; 6 . 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标; 7 . 设计或采用高效筛选方案和方法; (三)常用诱变剂的使用方法 1. 物理诱变:采用紫外线进行诱变育种时的操作步骤。 2. 化学诱变:采用 5-溴尿嘧啶(5-Bu) 进行诱变育种时的操作步骤。 (四)筛选策略 营养缺陷型突变株的筛选

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1 . 几个概念 营养缺陷型、野生型、原养型、 基本培养基、完全培养基、补充培养基 2 . 营养缺陷型的筛选方法 1)诱变处理; 2)淘汰野生型:抗生素法;菌丝过滤法; 3)检出缺陷型夹层培养法;限量补充培养法;逐个捡出法;影印接种法;鉴别缺陷型:生长 谱法; 二、诱变剂与致癌物质——Ames 试验 很多化学物质,能以各种机制导致 DNA 的突变,在利用各种它们获得各类遗传突变, 进行诱变育种,或对有害微生物进行控制的同时,它们也会危害人类自身的健康。 “生物化 学统一性” 法则: 人和细菌在 DNA 的结构及特性方面是一致的, 能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的 DNA,使其 发生突变, 最后造成癌变或其他不良的后果。 诱变剂的共性原则: 化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比;超过 95%的致癌物质 对微生物有诱变作用;90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。 1966 年,美国加利福尼亚大学的 Bruce Ames 教授于发明了检测这些化学物质的方法, 称为 Ames 试验。 具体操作: 检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突 变率。 回复突变(reverse mutation 或 back mutation):突变体失去的野生型性状,可以通过第二次 突变得到恢复,这种第二次突变称为回复突变 证明 Ames 试验重要性的应用实例: 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停” ,由于其药效显著,在 60-70 年 代十分流行, 但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高, 而且生产畸形儿的妇女大多曾服 用“反应停” ,后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用,因此这种药 物被禁止使用。 但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测, 那么这种大量出生畸形儿的悲剧 完全可以避免。 第五节 菌种保藏 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求,否则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素:变异;污染;死亡。 一、菌种的衰退与复壮 1、菌种衰退的原因:大量群体中的自发突变 2、菌种的复壮:1)从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来,重新获得具有原有典型性状 的菌种。 a) 纯种分离; b) 通过寄主体进行复壮; 2) 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性,在日常的菌种维护工作中 不断筛选“正变”个体。 二、防止衰退的措施

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1) 减少传代次数; 2) 创造良好的培养条件; 3) 经常进行纯种分离,并对相应的性状指标进行检查; 4) 采用有效的菌种保藏方法; 三、菌种保藏 基本要求:在一定时间内使菌种不死、不变、不乱 基本方法:生活态:培养基传代培养(斜面、平板) ;寄主传代培养; 休眠态:冷冻(液氮、低温冰箱) ;干燥(沙土管、冷冻真空干燥) ; 由于微生物的多样性, 不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性, 迄今为 止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。 因此, 在具体选择保藏方法时必须对被 保藏菌株的特性、 保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。 对于一些比较重要的微生 物菌株, 则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏, 以免因某种方法的失败而导致菌种 的丧失。 思考题: 1、微生物的质粒有什么作用,包括哪些类型? 2、诱变剂(物理、化学)如何作用于微生物? 3、简述 Ames 实验的原理和意义? 第九章 微生物生态 几个概念: 生态系统:在一定的空间内生物的成分和非生物的成分通过物质循环和能量流动互相作用、 互相依存而构成的一个生态学功能单位。 生态学:研究生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系的一门科学。 微生物生态学: 研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系。 包括各种环境中的微 生物的种类、分布;微生物和其它生物的关系;微生物与地球物质循环。 生物圈(biosphere) :地球上所有生物及其所生活的非生命环境的总称。 个体 群体 群落+非生物环境 生态系统 生物圈 第一节 微生物在生态系统中的作用 一、在生态系统中的角色 1、有机物的分解者 2、物质循环的重要成员 3、生态系统中的初级生产者 4、物质和能量的贮存者 5、微生物是地球生物演化中的先锋种类 主要作为分解者在生态系统中起重要作用 二、微生物与生物地球化学循环(自学! ) 生物地球化学循环(biogeochemical cycles) :指生物圈中的各种化学元素,经生物化学 作用在生物圈中的转化和运动。 1 . 碳循环 2 . 氮循环 第二节 生态环境中的微生物自然环境中的微生物一般都不是单独存在的, 常以个体、 种群、 群落和生态系统从低到高的组织层次分布。 种群(population) :具有相似特性和生活在一定空间内的同种个体群,是组成群落的基本组

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分。 群落(community) :在一定区域或一定生态环境内,各种生物群体构成的一个生态学结构 单位,群落中各生物群体之间存在各种相互作用。 一、 生态系统中生物之间的相互关系 1)有利: 互生:偏利作用;协同作用; 共生:互惠共生; 2)有害:寄生;捕食;竞争;偏害作用(拮抗) ; 3)无利无害—中立生活 (一) 、互生: 二种可以单独生活的生物,当它们生活在一起时,通过各自的代谢活动而有 利于对方,或偏利于一方的一种生活方式。 1)微生物间的互生关系:纤维素分解细菌与固氮菌。 2)人体肠道正常菌群(二)共生:二种生物共居在一起,相互分工协作、相依为命, 甚至形成在生理上表现出一定的分工, 在组织和形态上产生了新的结构的特殊 的共生体。1)微生物间的共生关系:2)微生物和植物间的共生关系:根瘤菌 与豆科植物间的共生形成根瘤共生体。菌根(土壤真菌与植物根形成的共生结构。 )3)微生 物与动物的共生关系(1)与昆虫的共生关系外共生:例如白蚁与其肠道内的微生物之间的 共生, 食木质的白蚁自身并不能分解期望上纤维素, 必须依赖肠道中 共生的原生动物和细菌通过厌氧发酵过程来分解纤维素。 内共生: 昆 虫与其细胞内的共生性细菌, 这些细胞内的共生性细菌能为宿主提供 B 族维生素,使昆虫能以缺乏维生素的植物为生。 (2)与反刍动物的 共生关系反刍动物,如牛、羊、骆驼、长颈鹿等以植物的纤维素为主要食物,它们在瘤胃中 经微生物发酵变成有机酸和菌体蛋白再供动物吸收利用。 瘤胃也为里面居住的微生物提供了必要的营养和生长条件。 (3)深海火山口细菌与蠕虫的共生关系(三) 、寄生:一种小型生物生活在另一种相 对较大型生物的体内或体表, 从中取得营养和进行生长繁殖, 同时使后者蒙 受损害甚至被杀死的现象。1)微生物间的寄生噬菌体—细菌;蛭弧菌—细 菌;真菌—真菌;真菌、细菌—原生动物。2)微生物与动植物间的寄生关系各种各样的致 病菌多是行寄生生活。择生生物,或称为悉生生物或定菌生物(Gnotobiote) :整个个体不 携带或只携带已知微生物的生物。 可用于科学研究,原因在于干扰因素少,操作易控制,既可进行定性分析,也可 进行定量分析,实验结果准确、可靠,对于了解微生物与宿主之间复杂的 关系及其机理具有十分重要的作用。 二、微生物在自然界的分布空气中的微生物 1)无原生的微生物区系; 2)来源于土壤、水体及人类的生产、生活活动; 3)种类主要为真菌和细菌,一般与其所在环境的微生物种类有关; 4)数量取决于尘埃数量; 5)停留时间和尘埃大小、空气流速、湿度、光照等因素有关; 6)与人类的关系:传播疾病、造成食品等的污染、制备微生物气溶胶实现群体免疫; 微生物学的基本技术:无菌操作技术 (二) 、水体中的微生物 1. 江河水 1)数量和种类与接触的土壤有密切关系; 2)分布上更多的是吸附在悬浮在水中的有机物上及水底;

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3)多能运动,有些具有很异常的形态(例如柄细菌) ; 4)靠近城市或城市下游水中的微生物多,并且有很多对健康不利的细菌,因此不宜作 为饮用水源; 5)水体自身存在自我净化作用: a)致病菌一般对营养要求苛刻,因此在一般的水中只能存活 2-3 天; b)水表微生物会受辐射等作用而被杀灭; c)原生动物等的吞噬作用; d)由固形物吸附再沉积到水底; 2. 海水 1)嗜盐,真正的海洋细菌在缺少氯化钠的情况下是不能生长的。 2)低温生长,除了在热带海水表面外,在其它海水中发现的细菌多为嗜冷菌。 3)大多数海洋细菌为 G—细菌,并具有运动能力。 4)耐高压(特别是生活在深海的细菌) 。Micrococcus aquivivus(水活微球菌)的 最适生长条件:600 个大气压。 3 . 水体的富营养化作用和―水花‖、―赤潮‖ (1) 富营养化的作用 水体中含大量的有机物或无机物,特别是磷酸盐和无机氮化合物 水的富营养化 藻类等过量生长,产生大量的有机物 异养微生物氧化这些有机物,耗尽水中的氧,使厌氧菌开始大量生长和代谢 鱼和好氧微生物大量死亡,水体出现大量沉淀物和异常颜色 (2) “水花”或“水华” (water bloom) : 藻类(主要是微藻)的大量繁殖使水体出现颜色,并变得浑浊,许多藻类团块漂浮在 水面上形成。 (3)赤潮或红潮(red tides) : 在海洋中,某些甲藻类大量繁殖也可以形成水花,从而使海水出现红色或褐色,称为 赤潮或红潮。 引起水体富营养化的藻类除通过消耗水中的氧气危害养殖业外, 很多藻类还能产生各种 毒素,使动物得病或死亡,因此由于富营养化作用致死的鱼等水产品不能食用。 (三) 、土壤中的微生物 土壤是固体无机物(岩石和矿物质)、有机物、水、空气和生物组成的复合物,是微生 物的合适生境。 土壤微生物种类多、数量多、代谢潜力巨大,是主要的微生物来源,是微生物的大本 营。 影响土壤微生物的数量和分布的因素: 1)主要受到营养物、含水量、氧、温度、pH 等因子的影响,并随土壤类型的不同而有很大 变化。 2)受季节影响; 3)与于土层的深度有关,一般土壤表层微生物最多,随着土层 的加深,微生物的数量逐步 减少。 (四) 、极端环境下的微生物 1、嗜热微生物 4、嗜碱微生物 2、嗜冷微生物 5、嗜盐微生物 3、嗜酸微生物 6、嗜压微生物

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研究意义: (1) 开发利用新的微生物资源,包括特异性的基因资源; (2) 为微生物生理、遗传和分类乃至生命科学及相关学科领域,如:功能基因组学、生物电 子器材等的研究提供新的课题和材料; (3) 为生物进化、生命起源的研究提供新的材料。 (五) 、不可培养的微生物 不可培养微生物(uncultured microorganisms) :从环境中直接分离并克隆 rRNA 并分析其序 列和在分子进化树上的位置等方法而发现的的目前尚不能在人工条件下获得培养的 微生物。 研究意义:生物多样性和系统发生的多样性(Biodiversity and Phylogenetic diversity;微生物 生态学的研究提出新的要求; 寻找新的致病微生物; 从不可培养微生物中寻找新 的基因、新的蛋白。 据报道, 美国Recombianant Biocatalysis Inc公司目前已从不可培养微生物中获得了约300 个与工业生产相关的新蛋白 (六) 、工农业产品上的微生物 1.微生物引起的工业产品的霉腐 大量工业制品都是用动植物产品作原料来制造的,如纤维制品、木制品、革制品、橡胶 制品、油漆、卷烟、化妆品等 有些工业产品如塑料、建筑涂料等也有很多微生物可以分解、 利用 微生物在各类工业产品上的生长所造成的产品的霉腐给人类造成了巨大的损失! 而另一方面, 有时也努力想开发并推广使用可被微生物降解的产品, 或利用微生物的降 解特性。如生物可降解塑料;开发、利用纤维素(能源、饲料) ;苎麻脱胶等。 2.食品、农副产品上的微生物 不利影响:由于微生物的生长繁殖而腐烂、变质,不能再食用或使用;病原微生物进入 人体的重要途径,引起传染性疾病;很多微生物在食品、农产品上生长后会产生对人有害的 毒素; 有利影响:利用特定的微生物制备风味食品,如酱制品、米酒、腌酸菜等; (七)活的非可培养状态 (viable but nonculturable state , VBNC state) 在常规培养条件下培养时不能生长繁殖, 但仍然是具有代谢活性的活菌。 一般表现为 细胞保持完整,胞内酶维持活性,染色体及质粒 DNA 均保持稳定,用显微镜观察,其细胞 会表现为缩小成球状, 细胞表面产生皱折等。 是细菌处于不良环境条件下时产生的一种特殊 的生存方式或休眠状态。 活的非可培养状态(viable but nonculturable state , VBNC state)现象的发现: 1982 年,徐怀恕(青岛海洋研究所)和 R R Colwell(美国 University of Maryland)通 过对霍乱弧菌和大肠杆菌在海洋与河口环境中的存活规律进行研究后首次提出, 近年来已成 为微生物学研究的一个热点。 证明 VBNC 可以复苏的手段: 1 )在 VBNC 所处环境中加入营养物质,但营养过于丰富并不利于 VBNC 的复苏。 2) 温度的改变,在低温下进入 VBNC 的细胞在环境温度升高后可以复苏; 3 )致病菌在宿主体内复苏; 4) 通过其它可培养的活菌的帮助而复苏; 例如在 Legionella pneumophila Philadelphia JR32 的 VBNC 细胞中加入 Acanthamoeba castellanii 可使前者复苏。

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第四节 微生物与环境保护 一、污染介质的微生物处理 几个概念: 水体的自净作用:自然界中,水体中的污染物浓度可通过河水向下游流动而自然降低, 此现象称为水体的自净作用。 污水:当经过水体的外来污染物质数量超过了水体的自净能力,并达到破坏水体原有用 途的程度。 微生物处理污水(waster treatment)的原理: 利用微生物的催化作用和代谢活性、 好氧和厌 氧分解, 吸收和转化污水中的污染物质, 将大量的有机物分解成无机盐。 CO2 和水,达到净化水体的作用。 (五日)生化需氧量(BOD5) :在特定的时间和温度下(通常 5 天,20℃) ,微生物氧 化 1 升污水中所含的有机物所消耗的氧量。 化学需氧量(COD) :使用强氧化剂(KMnO4,K2CrO7)使 1 升污水中的有机物迅速进 行化学氧化时所消耗的氧量。 生物降解(biodegradation) :是微生物(也包括其他生物)对物质(特别是环境污染物) 的分解作用。 (一)污水处理 1 .好氧处理系统 活性污泥法;生物膜法; 2 .污水中氮、磷的去除(脱氮工艺、脱磷工艺)

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进水 微 物 氮 艺 程 生 脱 工 流 回 流 好氧池 硝化作用 N2O NO NH NO3+ 4 -

反硝化作用

缺氧池

3

回 流

曝气池

氧化分解

N2
二沉池 剩余 污泥 出水

思考题 1)试论微生物与水体富营养化作用,你认为对此类污染该如何进行防治? 2)试用一些典型例子说明微生物与生物环境之间的相互关系。 3)微生物在生态系统中的地位怎样? 第十章 感染与免疫 病原微生物感染 机体对抗 免疫学

免疫(immunity):生物体能够辩认自我与非自我,对非我做出反应以保持自身稳定的功能。 传统的免疫概念:机体抵抗病原微生物的能力,即抗传染免疫。 本章主要内容:病原体对机体的感染 机体对感染的预防和治疗(非特异性免疫; 特异性免疫) 第一节 感染的一般概念 病原微生物(Pathogenic microorganism),或病原体(pathogen):寄生于生物(包括人)机体 并引起疾病的微生物。

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感染(infection), 又称传染: 机体与病原体在一定条件下相互作用而引起疾病的病理过程。 传染病:病原菌在机体内迅速繁殖并产生大有毒产物,使机体的细胞和组织严重受损,生理 功能出现异常,表现出一系列临床症状。 传染病的基本特征:有病原体、传染性、流行性、地方性、季节性、免疫性。一、感染的途 径和方式 外源性感染: 来源于宿主体外的感染, 主要来自病人、 健康带菌(毒)者和带菌(毒)动、 植物。 内源性感染: 当滥用抗生素导致菌群失调或某些因素致使机体免疫功能下降时, 宿主体内正 常菌群引起的 感染。 1、 感染的途径: 呼吸道感染;消化道感染;创伤感染;接触感染;垂直感染。
感染途径 呼吸道感 染 消化道感 染 传播媒体 举例

带菌唾液、痰液、尘 白喉杆菌: 白喉(抗毒素为 IgG) 埃 G+ 杆菌;产生外毒素(多肽)致病((抑制蛋白质合成);初 定殖于鼻粘膜上,终导致窒息而死 污染的饮食、水源、 肝炎病毒(RNA/DNA): 肝炎(初定殖于肠粘膜、淋巴 家具、苍蝇、蟑螂 结、后致肝细胞)。 病毒本身损伤肝细胞代谢,病毒应起的机体免疫应答 损伤肝细胞。 皮肤、粘膜的损伤、 流行性乙肝脑膜炎病毒: 乙脑(库蚊、伊蚊) 。RNA, 吸血昆虫 初定殖于毛细血管内批细胞和淋巴结,后进入血流, 终至大脑皮质、基底结和脑干等,引起脑组织坏死, 炎症。 人—人、人—动物的 麻风杆菌: 麻风病。寄生于细胞内,菌可随患者的鼻 接触 腔分泌物、痰、汗、乳汁、精子和阴道分泌物排出。 主要侵犯皮肤粘膜和外周神经组织。 胎盘、产道(亲代传 疱疹病毒: 疱疹性的腔炎。湿疹或疱疹病毒性脑炎、 给子代) 肝炎,发病与机体免疫力有关。

创伤感染

接触感染

垂直传播

2. 感染的部位及方式 a) 大多数病原体不能穿过完整的皮肤,而是通过机体的自然开口、皮肤表面的创伤 裂口,或通过导管、静脉注入或外科切口等医 源性的途径,进入机体内部。 b)极少数能穿过皮肤(如血吸虫、钩虫) ; c)有的能穿过粘膜(如脊髓灰质炎病毒、麻诊病毒) ,然后通过血循环到达特定组织部 位、造成病变;有的(如白喉杆菌)能附着在粘膜 上生长繁殖形成局部病灶,产生 毒素,引起各种症状。 病原体侵入人体后寄生和造成病变的方式: 细胞外感染 细胞内感染 兼性细胞内感染:某些细菌、真菌等被吞噬细胞吞噬后不被杀死,反而在细胞内增 殖。 专性细胞内感染:所有的病毒、立克次氏体、衣原体及少数细菌和原虫只能在靶细 胞内增殖,它们必须存在于细胞内才能引起感染。 二、微生物的致病性 (一)细菌的致病性 细菌的致病性是对特定宿主而言,能使宿主致病的为致病菌,反之为非致病菌,但二 者并无绝然界限。 条件致病菌(opportunistic pathogen)或机会致病菌: 在一般情况下不致病, 但在某些条件

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改变的特殊情况下可致病。 致病力:指病原物的致病能力,取决于病原物的侵袭力和所产生的毒素。 1 .侵袭力(invasiveness): 病原菌突破宿主防线,并能于宿主体内定居、繁殖、扩散的能力,称为侵袭力。 1) 粘附与侵入: 细菌通过具有粘附能力的结构如革兰氏阴性菌的菌毛粘附于宿主的呼吸道、 消化道及泌尿生殖道粘膜上皮细胞的相应受体, 于局部繁殖, 积聚毒力或继 续侵入机体内部。2)亲器官性:如肝炎病毒定植于肝细胞;肺炎球菌定植 于呼吸道粘膜。 3)抗吞噬细胞因子:细菌的荚膜和微荚膜具有抗吞噬和体液杀菌物质的能力;致病性葡萄 球菌产生的血浆凝固酶有抗吞噬作用; 分泌一些活性物质如溶血素, 抑 制白细胞的趋化作用; 具抵抗在吞噬细胞内被杀死的能力, 能在吞噬细 胞内寄生。 4)侵袭酶:通过水解性酶类,使组织疏松、通透性增加,有利于病原菌扩散。如透明质酸 酶、链激酶、凝固酶等。 2)毒素(toxin) 按其来源、性质和作用的不同分为外毒素和内毒素。 (1)外毒素(exotoxin) :主要是一些革兰氏阳性菌,在生长过程中合成并分泌到胞外的毒 素(如破伤风痉挛毒素、白喉毒素) ;也有存于胞内当细菌溶解后才释放的毒 素(如痢疾志贺菌的肠毒素) 。 特点:是蛋白质;抗原性强;具有选择性,可选择作用于各自特定的组织器官;毒性 作用强,但毒性不稳定,对热和某些化学物质敏感;不同病原菌产生的外毒素 不同,所引起的症状也不同。 类毒素:利用外毒素对热和某些化学物质敏感的特点,用 0.3-0.4%甲醛处理,使其毒性 完全丧失, 但仍保持抗原性, 这种经处理的外毒素为类毒素, 常用来预防注射。 抗毒素:用类毒素注射动物(如马) ,制备外毒素的抗体,此抗体称为抗毒素,可作治 疗用。 例如:破伤风梭菌的破伤风痉挛毒素(tetanospamin)和破伤风溶血毒(tetanolysin)。 (2)内毒素(endotoxin) :革兰氏阴性细菌的细胞壁物质,主要成分是脂多糖(LPS),于菌 体裂解时释放。 特点:是脂多糖;抗原性弱;毒性弱,对机体组织器官没有选择性;耐高温(100℃、 1h 不能被破坏) ;所引起的症状基本相同(作用于白细胞、血小板、补体系统、 凝血系统等多种细胞和体液系统,引起发热、白细胞增多、血压下降及微循环 障碍等) 。 外毒素与内毒素的比较:

项目 产生菌 化学成分 释放时间 致病特异性 毒性 抗原性 制成类毒素 热稳定性

外毒素
革兰氏阳性菌为主 蛋白质 一般随时分泌 不同外毒素各不相同 强* 完全抗原,抗原性强 能 差

内毒素
革兰氏阴性菌 脂多糖(LPS) 菌体死亡裂解后释放 不同病原菌的内毒素作用基本相同 弱 不完全抗原,抗原性弱 不能 耐热性强

*1mg 肉毒毒素纯品可杀死 2 亿(2000 万)只小鼠或一百万只豚鼠,中毒的死亡率几

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近 100%, 但及时注射抗毒素及对症治疗可使之降低。 1mg 破伤风毒素可杀死 100 万只小鼠, 1mg 白喉毒素可杀死 1000 只豚鼠。 (二) 病毒的致病性 病毒感染的特点:活细胞中寄生;基因水平感染。 病毒在宿主细胞内增殖,影响宿主细胞的核酸及蛋白质代谢,其后果可分为三种类型: 杀细胞感染(cytocidal infection) ; 稳定状态感染(steady state infection) ; 整合感染(integrated infection) ; (三) 真菌的致病性: (1)致病性真菌感染:一些外源性真菌感染可引起皮肤、皮下和全身性疾病。 (2)条件致病性真菌感染:一些内源性真菌在机体免疫力降低,如长期应用抗生素、 放射治疗等情况下发生。如:脑膜炎 (3)真菌变态反应性疾病:有些真菌本身并不致病,但对某些具过敏倾向的个体可引 起变态反应性疾病,如荨麻疹、哮喘、过敏性鼻炎。 (4)真菌性中毒:有些真菌在粮食上生长,人及动物食后可因真菌本身或真菌产生的 毒素而中毒。 三、传染后的表症 1)病原体侵入其宿主后,二者之间的力量对比决定着传染的结局:隐性传染;带菌状态; 显性传染。 不同的个体或相同个体的不同生理状态可能产生不同的结果。 隐性传染:如果宿主的免疫力很强,而病原体的毒力相对较弱,数量又较少,传染后只引起 宿主的轻微伤害,且很快就将病原体彻底消灭,因而基本上不表现临床症状。 带菌状态: 如果病原体与宿主双方都有一定的优势, 但病原体仅被限制于某一局部且无法大 量繁殖,二者长期处于僵持状态,就称为带菌状态。 这种长期处于带菌状态的宿主,称为带菌者,成为该传染病的传染源,十分危险。 如: “伤寒玛丽” (真名:Mary Mallon) :一个健康带菌者,被证实在美国有 7 个地区多 达 1500 个伤寒患者都是她传染的。 显性传染:如果宿主的免疫力较低,或入侵病原菌的毒力较强、数量较多,病原菌很快在体 内繁殖并产生大量有毒产物, 使宿主的细胞和组织蒙受严重损害, 生理功能异常, 于是就出现了一系列临床症状。 2)按发病时间的长短分为急性传染和慢性传染。 急性传染:病程仅数日至数周,如流行性脑膜炎和霍乱等;多为细胞外寄生物引起。 慢性传染:病程往往长达数月至数年,如结核病、麻风病等。多由细胞内寄生物引起。 第一节 宿主的非特异性免疫 非特异性免疫 non specific immunity(天然免疫 innate immunity) :指机体对病原微生物的 一般生理防卫功能, 是在种系发育过程中形成的。 机体对入侵的致病因子无需 特殊的识别过程而直接对其加以防御。 天然免疫的组成

生理屏障 体液因素 细胞因素 其它

皮肤、粘膜及其附属物、共生菌群
溶菌酶、补体、干扰素 吞噬细胞、自然杀伤细胞 免疫的综合作用等

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一、生理屏障 1 表面屏障:皮肤、粘膜、分泌物 1)机械的阻挡和排除作用; 2)分泌液中所含化学物质有局部抗菌作用; 2 局部屏障: 血脑屏障:主要由软脑膜、脉络丛、脑毛细血管壁及其外的脑星形细胞组成,可阻 挡病原体及其有毒产物从血液透入脑组织或脑脊液,保护中枢神经系统的稳定。 胎盘屏障:由怀孕母体子宫内膜的基蜕膜和胎儿的绒毛膜滋养层细胞共同组成,能 阻挡病原微生物由母体通过胎盘感染胎儿,但并不妨碍母子间的物质交换。 共生菌群:竞争必要的营养物;产生如象大肠杆菌素、酸类、脂类等抑制物,而抑制 多数具有疾病潜能的细菌或真菌生长。 二、体液因素 1、 补体系统 (complement system) 存在于正常机体体液或血清中的非特异性的杀菌物质, : 包括廿余种蛋白质成分。 主要由肝细胞和巨噬细胞产生,通常以无活性形式存在于正常血清和体液中。 补体激活: 在一定条件下促发补体系统的一系列酶促级联反应, 使补体由无活性形式 转变为对病原体具有杀灭作用的活性形式。(1)补体激活及激活途径: 经 典途径、替代途径。 (2) 补体功能(作用)溶解和杀伤细胞; 中和病毒; 趋化作用; 免疫粘附作用; 过敏毒素 (促 进炎症)作用。 2、干扰素(interferon, IFN) 定义:宿主淋巴细胞在病毒等多种诱生剂刺激下产生的一类低分子量糖蛋白,分?、?、 ??三组。作用: 干扰素作用于宿主细胞,使之合成抗病毒蛋白、控制病毒蛋白 质合成,影响病毒的组装释放;具有广谱抗病毒功能; 同时,还有多方面的 免疫调节作用。干扰素诱生机理干扰素的作用机制溶菌酶(lysozyme) 14.7KD 不耐热的碱性蛋白,主要来源于吞噬细胞并可分泌到血清及各种分泌液中, 能水解革兰氏阳性菌胞壁肽聚糖而使细胞裂解。 溶菌酶也存在于鸡蛋清和某些细菌中, 可提 纯并加工制成各种制剂,用于治疗中耳炎、咽喉炎、副鼻窦炎等慢性疾病。体液中还有β 溶 解素(β -lysin)、转铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、C 反应蛋白等多种能杀菌或抑菌的因素,但直 接作用很弱,仅在机体免疫中起辅助作用。 三、细胞因素 主要是指体内的各种吞噬细胞吞噬病原体及其它各种异物的能力。 1、 吞噬细胞 种类:大吞噬细胞(单核吞噬细胞系统) :单核细胞(血液中;吞噬作用和形成巨噬细胞) ; 巨噬细胞(组织中;吞噬作用) ; 小吞噬细胞: (嗜)中性粒细胞(多形核白细胞) (骨髓、血液中;吞噬作用) : 功能:吞噬并销毁外来微生物和其他颗粒;巨噬细胞可分泌多种可溶性因子,不但有加强 杀菌促进炎症的作用,还具有免疫调节等重要功能;作为抗原提呈细胞,是特异性 免疫的重要组成部分。 吞噬过程 吞噬结果:完全吞噬:病原体被吞噬、杀灭。 不完全吞噬:病原体被吞噬,不杀灭,可 在胞内增殖。 2、 自然杀伤细胞(NK 细胞) NK 细胞属于淋巴细胞,主要分布于外周血和脾脏;

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具有不须事先致敏,不须其它辅助细胞或分子的参与而直接杀伤靶细胞的功能; NK 细胞通过释放穿孔素(perforin)和颗粒酶造成靶细胞死亡,也可通过释放肿瘤坏死 因子(TNF)杀伤靶细胞; 某些肿瘤细胞和微生物感染细胞可以成为 NK 细胞的靶细胞,而且 NK 细胞的活性较其它杀伤细胞更早出现,因此 NK 细胞在抗肿瘤抗 感染特别是病毒感染中起重要作用。 四、炎症(inflammatory) 定义: 炎症是机体受到有害刺激时所表现的一系列局部和全身性防御应答, 可以看作是 非特异性免疫的综合作用结果。 作用:清除有害异物、修复受伤组织,保持自身稳定性。 症状: 内、外源性热原物质作用于下丘脑导致发热(发烧) ; 吞噬细胞的溶酶体酶释放或泄漏会损伤自身组织成分; 各种毒性产物与活性介质将刺激正常机体组织; 死亡白细胞与破坏裂解的靶细胞共同酿成脓液(化脓) ; 红、肿、痛、热和功能障碍(炎症) 炎症既是一种病理过程,又是一种防御病原体的积极方式,其意义在于: 1) 员了大量的吞噬细胞聚集在炎症部位; 2) 血液中的抗菌因子和抗体发生局部浓缩; 3) 死亡宿主细胞的堆积可释放抗微生物物质; 4) 炎症中心氧浓度下降和乳酸积累,进一步抑制病原菌的生长; 5) 适度的体温升高可以加速免疫反应的进程; 第三节 宿主的特异性免疫 一、特异性免疫(specific immunity) 1、 定义: 机体在生命过程中接受抗原性异物刺激, 如微生物感染或接种疫苗后产生的免疫, 又称获得性免疫(acquired immunity)。

自动免疫 自然的 人工的
显性 或隐 性感染 接种疫苗

被动免疫
经 胎 盘 或乳 汁 由 母 体传递给婴儿 输入免疫细胞、抗血 清或其它制剂

2 . 免疫系统 1) 免疫器官: 中枢免疫器官:功能:分化免疫细胞种类:骨髓:分化成血干细胞、 B 细胞(哺乳动物) 胸腺:分化 T 淋巴细胞 法氏囊(鸟类) :分化 B 细胞 周围免疫器官:功能:免疫细胞居住和免疫应答的场所 种类:淋巴结(净化淋巴液) 脾脏 (净化血液) 粘膜相关淋巴组织(局部防御功能) 2)免疫细胞: 淋巴细胞:T 细胞(T 辅助细胞 TH,杀伤性 Tc,抑制性 T 细胞 Ts) :细胞免疫 B 细胞: 体液免疫第三类淋巴细胞:NK 细胞,K 细胞(杀伤靶细胞)粒细胞(嗜中性、嗜酸性、嗜碱 性) 、肥大细胞、树突细胞、红细胞

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单核吞噬细胞系统:趋化作用、吞噬杀伤作用 3)免疫分子: 膜表面免疫分子:膜表面抗原受体:位于 T 细胞、B 细胞表面 主要组织相容性抗原:参与 T 细胞对抗原的识别并自我识别 白细胞分化抗原(CD 抗原) 粘附分子 体液免疫分子:抗体,补体,细胞因子(由免疫细胞分泌) 二、抗原和抗体 (一)抗原(antigen,Ag) 定义: 能诱导机体产生体液抗体和细胞免疫应答,并能与抗体和致敏淋巴细胞在 体 内外发生特异性结合反应的物质。 特性:免疫原性:抗原在体内激活免疫系统,使其产生抗体和特异效应细胞的特性。 反应原性: 抗原能与相对应的免疫应答产物(抗体及致敏淋巴细胞)发生特异性 结合和反应的能力。 特异性:抗原决定簇 完全抗原(免疫原) :具免疫原性和反应原性的抗原。 半抗原:仅具反应原性的抗原。 1)抗原免疫原性的物质基础: 异物性; 分子量大小; 化学结构与组成; 2)抗原决定簇(antign determinant) ,或表位(epitope) : 抗原物质上能够刺激淋巴细胞产生应答并与其产物特异反应的化学基团。 它是抗原特 异性的物质基础。抗原所携抗原决定簇的数目称为抗原价,一般抗原是多价的。? (二)抗体(antiboby, Ab) 定义: 机体在抗原物质刺激下所形成的一类能与抗原特异结合的血清活性成分, 又称免疫球 蛋白(immunoglobulin, Ig) 。抗体是由 B 细胞合成并分泌的。? 1 . 基本结构: Y 字型 2 . 种类: IgG , IgA , IgM,IgE , IgD 3 . 功能: 与抗原特异结合;激活补体;结合细胞(免疫细胞);

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三、免疫应答 (一)免疫应答的基本过程 感应阶段 反应阶段 效应阶段

1. 感应阶段:机体接受抗原刺激的阶段。

抗原

巨噬细胞

T细胞

细胞免役 B细胞 体液免役

? ?

免疫活性细胞表面有抗原受体,所以能够识别抗原。 每个淋巴细胞表面只有一种抗原受体,只能识别一种抗原, 当它们结合后,抗原刺激细胞增殖、分化而产生免疫应答。

2. 反应阶段:淋巴细胞识别抗原后,即被活化进行增殖、分化。 1) 特异性抗原激活的 T 细胞转化为淋巴母细胞,再增殖、分化,成为有免疫效应的致 敏淋巴细胞。 2) 特异性抗原激活的 B 细胞被活化后,转化为浆母细胞,再增殖、分化为浆细胞,分 泌抗体。 记忆细胞 :受抗原刺激的淋巴细胞在分化过程中,有一部分细胞在中途停顿下来,不再 增殖分化,在体内能较长时间存在。当再次受到同种抗原刺激时,能迅速分化 增殖成大量致敏淋巴细胞和浆细胞, 分别产生大量淋巴因子及抗体, 这类免疫 细胞称为记忆细胞。

3. 效应阶段:抗原成为被打击的对象。 1) 胞介导的体液免疫: 体液中的抗体与相应的抗原进行特异性结合, 发挥免疫效应的 过程。 2) 胞介导的细胞免疫: 致敏淋巴细胞通过与相应的抗原接触直接杀伤病原靶细胞, 或 释放多种可溶性的生物活性物质(细胞因子) ,发挥免疫效应。 第四节 免疫病理 一、超敏反应(变态反应) 青霉素过敏:I 型变态反应

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二、自身免疫病 三、移植免疫 四、免疫缺陷 如:人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的获得性免疫缺陷综合症(AIDS) 第五节 免疫学的实际应用 一、抗原抗体反应 血清学反应: 指在体外进行的抗原抗体的特异性反应, 出现凝集、沉淀等现象。可用已 知抗体检查未知抗原,也可用已知抗原检查未知抗体。 (一) 一般规律 1.反应的组成:抗原、抗体、环境因素(电解质、温度、酸碱度、补体、白细胞等) 2.反应的基本特点:a 抗原抗体的结合具有特异性; b 抗原与抗体是分子表面结合,一般较稳定,但抗原的性质不变。 c 抗原抗体形成的可见反应与抗原抗体的相对浓度有关,即与两 者的比例有关。只有当两者的比例合适才能形成大分子集团。 d 抗原抗体反应分为两个阶段:结合阶段,反应阶段。 (二) 凝集反应 定义:颗粒性抗原(细菌、血细胞)与相应抗体在适量电解质环境中相互作用,经 过一段时间出现肉眼可见的凝集现象,称为凝集反应。 抗原:称为凝集原 抗体:称为凝结素 (三)沉淀反应 定义:可溶性抗原(蛋白质、多糖、脂类、血清、各种微生物培养液)与相应抗体 在电解质存在的适当条件下相遇,经过一段时间出现肉眼可见的沉淀现象, 称沉淀反应。 抗原:沉淀原 抗体:沉淀素 疫苗:微生物疫苗:活疫苗、死疫苗、类毒素 亚单位疫菌:化学疫苗、基因工程疫苗 抗独特性疫苗:抗抗体 疫苗是抗原

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特异性免疫与非特异性免疫的关系 非特异性 免疫 特异性 免疫 B细胞 (抗体) 结合病菌后激活补体
协助 抗体形成

协助抗体杀灭病菌

补体



调 理 作 用

调理作用

吞噬细胞 (细胞因子)调理作用 协助T细胞分化 表面屏障 干扰素、溶菌酶 NK细胞

T细胞 (致敏T细胞:细胞因子; 细胞毒T细胞)

思考题 1. 病原微生物是怎样侵害机体的??为什么说感染不是疾病的同义词? 2. 对细菌内毒素和细菌外毒素的免疫应答有何不同? 3. 补体、抗体的生物学功能及免疫应答的基本过程。? 4. 什么是天然免疫和特异性免疫?试举例说明二者之间并无截然界限。 5. 机体可通过哪些方式获得免疫力?? 第十一章 微生物的进化、系统发育和分类鉴定 大约 46 亿年前,地球形成; 大约 35 亿年前,通过“前生命的化学进化”过程 地球上开始出现生命,主要是些类似简单杆状细菌的原始生物。

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最原始的生命

漫长的进化历程

千姿百态的生物种类

今天仍生存在地球上的生物种类, 彼此之间都有或远或近的历史渊源。

进化(evolution):生物在与其生存环境相互作用过程中, 其遗传系统随时间发

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